A baktériumok elemei. A bakteriális genom felépítése
Bakteriális genomönálló replikációra képes genetikai elemekből áll, azaz. replikonok. A replikonok azok bakteriális kromoszómaÉs plazmidok.
Az örökletes információt a baktériumok DNS-nukleotidok szekvenciája formájában tárolják, amelyek meghatározzák az aminosavak szekvenciáját egy fehérjében. Minden fehérjének megvan a saját génje, vagyis a DNS-en egy diszkrét régió, amely a nukleotidszekvencia számában és specifitásában különbözik.
Bakteriális kromoszóma egy kétszálú DNS-molekula, kör alakú. A bakteriális kromoszóma méretei a királyság különböző képviselőiben Procaryotae változnak. A bakteriális kromoszóma a baktériumsejt kompakt nukleoidját alkotja. A bakteriális kromoszóma haploid génkészlettel rendelkezik. A baktériumsejt számára létfontosságú funkciókat kódol.
Plazmidok A baktériumok kétszálú DNS-molekulák. Olyan funkciókat kódolnak, amelyek nem nélkülözhetetlenek egy baktériumsejt életéhez, de amelyek kedvezőtlen életkörülményeknek kitéve előnyöket biztosítanak a baktériumnak.
A mikroorganizmusok tulajdonságait, mint minden más szervezetet, azok határozzák meg genotípus, azaz egy adott egyed génjeinek összessége. A „genom” kifejezés a mikroorganizmusokkal kapcsolatban szinte egyet jelent a „genotípus” fogalommal.
Fenotípus a genotípus és a környezet kölcsönhatásának eredménye, azaz a genotípus konkrét életkörülmények között való megnyilvánulása. A mikroorganizmusok fenotípusát, bár a környezettől függ, a genotípus szabályozza, mivel az adott sejtben lehetséges szűkületi változások természetét és mértékét egy sor gének határozzák meg, amelyek mindegyikét a DNS egy bizonyos szakasza képviseli. molekula.
A változékonyság középpontjában vagy a genotípus környezeti tényezőkre adott válaszának megváltozása, vagy magának a genotípusnak a változása génmutáció vagy rekombináció eredményeként. Ebben a tekintetben a fenotípusos variabilitást örökletesre és nem örökletesre osztják.
A nem öröklődő (környezeti, módosulási) variabilitást az intra- és extracelluláris tényezőknek a genotípus manifesztációjára gyakorolt hatása okozza. Ha a módosítást okozó tényezőt megszüntetjük, ezek a változások eltűnnek.
A mutációkkal összefüggő örökletes (genotípusos) variabilitás a mutációs variabilitás. A mutáció alapja a DNS-ben a nukleotidok szekvenciájának megváltozása, azok teljes vagy részleges elvesztése, azaz a gének szerkezeti átrendeződése következik be, ami fenotípusosan egy megváltozott tulajdonság formájában nyilvánul meg.
A rekombinációhoz kapcsolódó öröklődő variációt rekombinációs variációnak nevezik.
Mobil genetikai elemek.
A bakteriális genom, mind a bakteriális kromoszóma, mind a plazmidok összetétele magában foglalja mobil genetikai elemek. A mobil genetikai elemek közé tartoznak az inszerciós szekvenciák és a transzpozonok.
Beszúrás (beszúrás) szekvenciák Az IS-elemek olyan DNS-szakaszok, amelyek egészükben képesek mozogni a replikon egyik szakaszából a másikba, valamint a replikonok között. Csak azokat a géneket tartalmazzák, amelyek a saját mozgásukhoz – transzpozícióhoz – szükségesek: az enzimet kódoló gén transzponálás, biztosítja az IS elem DNS-ből való kizárásának folyamatát és új lókuszba való beépülését, valamint egy gént, amely meghatározza a teljes mozgási folyamatot szabályozó represszor szintézisét.
Az IS elemek megkülönböztető jellemzője a beillesztési szekvencia a végeken fordított ismétlődések. Ezeket a fordított ismétlődéseket az enzim felismeri transzponálás. A transzpozáz egyszálú töréseket hajt végre a transzponálható elem két oldalán elhelyezkedő DNS-szálakban. Az IS elem eredeti példánya ugyanazon a helyen marad, és a replikált másolata egy új helyre kerül.
A mobil genetikai elemek mozgását általában replikatív vagy illegitim rekombinációnak nevezik. A bakteriális kromoszómákkal és a plazmidokkal ellentétben azonban a mobil genetikai elemek nem független replikonok, mivel replikációjuk szerves eleme annak a replikonnak a DNS-replikációjának, amelyben elhelyezkednek.
Az IS-elemeknek több fajtája ismert, amelyek méretükben, valamint az inverz ismétlődések típusában és számában különböznek egymástól.
Transzpozonok- ezek olyan DNS-szegmensek, amelyek tulajdonságai megegyeznek az IS elemekkel, de strukturális génekkel rendelkeznek, azaz olyan gének, amelyek olyan molekulák szintézisét biztosítják, amelyek meghatározott biológiai tulajdonsággal rendelkeznek, például toxicitást, vagy antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát biztosítanak.
Egy replikon mentén vagy replikonok között mozogva a mobil genetikai elemek a következőket okozzák:
1. A DNS azon szakaszainak génjeinek inaktiválása, ahol azok elmozdulva integrálódtak.
2. A genetikai anyag károsodásának kialakulása.
3. Replikon fúzió, azaz a plazmid beépítése a kromoszómába.
4. Gének eloszlása egy baktériumpopulációban, amely a populáció biológiai tulajdonságainak megváltozásához, a fertőző betegségek kórokozóinak megváltozásához vezethet, valamint hozzájárul a mikrobák közötti evolúciós folyamatokhoz.
A baktériumok genomjában, következésképpen a baktériumok tulajdonságaiban változások következhetnek be mutációk és rekombinációk következtében.
Felfedeztek magasabb rendű organizmusokat, onkogéneket stb. (lásd: Migrációs genetikai elemek).
AZ ELEMEK ÉS A TRANSPOZONOK BAKTÉRIUMBAN
A transzpozonok a plazmidokkal és fágokkal együtt (amelyekbe könnyen integrálódnak) képesek a bennük lévő különféle géneket nagyon távoli baktériumfajok között kicserélni, ezért rendkívül fontos szerepet töltenek be a baktériumok evolúciójában, beleértve a lekhez való alkalmazkodásukat is. . Önben és új méreganyagok termelésében.
A transzpozonok és 15 elem felelős a baktériumok genetikai jelenségeinek egy soráért. Egy transzponálható elem génbe történő beépítése annak inaktiválásához vezethet. Ezenkívül egyes IS-elemek és transzpozonok genetikai instabilitást okoznak a lokalizációjuk helyének közelében, az elem közelében, a deléciók és inverziók gyakorisága észrevehetően megnő, és az átrendeződés egyik határa mindig egybeesik az elem egyik végével. 15 elemből álló, autonóm vagy egy transzpozon részeként. A mobil elemek is okozhatnak transzlokációt. Valójában két egymástól bizonyos távolságra elhelyezkedő IS-elem transzpozonnak tekinthető, és az ilyen transzpozonok valóban képesek egyetlen egységként mozogni, bár legalább néhány IS-elem esetében kimutatták, hogy az ilyen transzpozonok mozgási gyakorisága A kompozit szerkezet gyorsan csökken a szomszédos IS elemek közötti távolság növekedésével.
Hasonló paradoxonok. feloldható, ha emlékezünk arra, hogy mind a plazmidok, mind a mobil genetikai elemek komparatív autonómiával rendelkeznek a genetikai anyag nagy részétől, ezért egyfajta, speciális, genetikai környezetben élő organizmusnak tekinthetők. A plazmidok, IS-elemek és transzpozonok funkcióit tehát nem abból a szempontból vizsgálhatjuk, hogy milyen előnyökkel járnak a gazdabaktérium számára, hanem a baktériumpopulációkban való önfenntartásuk szempontjából, más szóval: figyelembe veheti az önző DNS prokariótáinak autonóm elemeit, biztosítva az első körben a saját szaporodást. Ebben az értelemben. a mobil elemek és plazmidok közvetlenül szomszédosak a vírusokkal, amelyek önző hajlamai nyilvánvalóak.
Mely gének bizonyulnak hasznosnak és szerepelnek a mobil elemekben? Ez nem tétlen kérdés, hiszen minden baktériumsejt jól alkalmazkodik a környezetéhez, és nincs szüksége a már meglévő génekre, és biztosítja az alkalmazkodást a környezet. Másrészt úgy tűnik, hogy a teljesen új környezethez való alkalmazkodás a sejt genetikai anyagának viszonylag jelentős átrendeződését igényli, beleértve különösen sok különböző gén együttes adaptációját. Ezért egy sejt csak akkor szerezhet szelektív előnyt egy gén megszerzésével (a transzpozon részeként), ha ez a gén bizonyos körülmények között maga is képes jótékony hatást gyakorolni a baktériumra, vagyis éppen ezek a gének hasznosak a transzpozonok számára. hogy összetételükben legyen. Valójában a különféle bakteriális mérgekkel – köztük nehézfémekkel és antibiotikumokkal – szembeni rezisztenciát okozó gének transzpozonokon utaznak, további anyagcsere-utakat biztosító gének, lehetővé téve például valamilyen szokatlan gén, végül pedig egyes toxinok gének használatát, ami a baktériumokat kórokozóvá és kórokozóvá teszi. ezáltal lehetővé téve számukra, hogy jelentősen megváltoztassák életmódját.
| Rizs. 15.13. Transzpozonok azonosítása heteroduplexek elektronmikroszkópos vizsgálatával. A transzpozon láthatóvá tétele érdekében a vad típusú baktériumból (B) és a transzpozont hordozó baktériumból (A) származó DNS-t felmelegítik, aminek következtében a kettős spirális láncok szétválnak (olvadnak). A keverék ezt követő lassú lehűtésével az egyes DNS-szálak A és B komplementer bázisainak párosítása következik be, ami DNS-heteroduplexek kialakulásához vezet. Ha a transzpozon végein ellentétes orientációjú komplementer IS elemek találhatók, akkor ezek a régiók is párosodnak és szárat alkotnak, amelyen a transzpozon középső része oldalirányban, egyetlen szál hurok formájában nyúlik ki. |
A bakteriális transzpozonok szerkezeti felépítése hasonló (2.1. ábra). Mindegyiket korlátozzák a terminális fordított ismétlődések, amelyek hossza és összetétele a különböző transzpozonok között változik (tíztől több száz bp-ig). Egy bizonyos transzpozon esetében azonban egyedi állandók, azaz nem változnak, amikor különböző helyekre kerül be. A bakteriális transzpozonok jellegzetessége, hogy mindkét végükön a recipiens DNS (cél DNS) közvetlen ismétlődései határolják őket. Ezeknek az ismétlődéseknek a hossza 5 és 9 bp között változik, de egy adott elem esetében állandó. Az ismétlődő nukleotidok sorrendjét az elem elhelyezkedése határozza meg. A független eredetű helyeken a transzpozont különböző összetételű ismétlődések szegélyezik.
Transzpozonok okozta mutációk. A baktériumok genetikájában egyre fontosabbá válik a mutációk transz-pozonok felhasználásával történő előállítási módja. A transzpozonok (Tn) rövid kettős DNS-szálak, amelyek több mint 2000 bázispárból állnak, és általában egy antibiotikummal, kivételes esetekben több antibiotikummal szemben is rezisztenciát okoznak. A transzpozonok képesek átugrani a genom egyik régiójából a másikba, különösen egy A bakteriális kromoszómák a plazmidba és vissza ilyen módon beépülhetnek a genom különböző részeibe (lásd a 15.3.1. pontot) Ha a kromoszóma bármely szerkezeti génjébe transzpozont viszünk be, ennek a génnek a nukleotidszekvenciája megszakad és a genetikai információ nem fordítható le működőképes teljes polipeptiddé. Egy inszerciós mutáns fog megjelenni.
Fentebb már említettük, hogy a mobil elemek genetikai instabilitást okoznak a lokalizációs helyük közelében. Ez a tulajdonság könnyen magyarázható az IS elemek és a baktériumok transzpozonjainak már ismert tulajdonságaival. A 80. ábra azt mutatja, hogy mi történik, ha egy Tn3 típusú transzpozon elmozdul egy replikonon belül, pl. replikatív transzpozíciós mechanizmussal. Attól függően, hogy a töréseket hogyan vezetik be a cél-DNS-be, vagy deléciót vagy inverziót kap a genetikai anyagban a transzpozon helye és mozgásának célpontja között. Valójában a deléció kialakulása hasonlít a kointegrációs bomlás folyamatára, de mivel az egyik létrejött DNS-molekulának nincs replikációs origája, elveszik. Ha inverzió következik be, akkor mindkét határán a transzpozon másolata található egymáshoz képest fordított orientációban. Így a deléciók és inverziók kialakulása a transzpozíciók replikációs mechanizmusára jellemző.
A bakteriális transzponálható elemek kulcsfontosságú tulajdonsága, amely biztosítja megőrzésüket, hogy képesek replikonról replikonra mozogni. Az átvihető és mobilizálható plazmidok baktériumokban való jelenléte lehetővé teszi, hogy a transzpozonok és IS elemek ne csak plazmidról plazmidra vagy kromoszómáról plazmidra mozogjanak, hanem a plazmidok részeként sejtről sejtre is. Ily módon a mobil elemek szétterjedhetnek a baktériumpopulációkban, még akkor is, ha nem nyújtanak semmilyen előnyt gazdáiknak. Ezzel kapcsolatban érdemes megemlíteni a transzpozícióval szembeni immunitás jelenségét: sok transzpozon és IS elem sokkal valószínűbb, hogy új replikonokba költözik, mint a replikon egy új helyére, amelyben elhelyezkednek. Ennek a tulajdonságnak a molekuláris mechanizmusa még nem tisztázott, de nyilvánvaló, hogy elősegíti a transzponálható elem eloszlását a maximális replikonszámon keresztül.
A különböző replikonokon elhelyezkedő azonos IS elemek és transzpozonok képesek elősegíteni a homológ rekombinációt, ami kointegrátum kialakulásához vezet. Ily módon egyes plazmidok reverzibilisen beépülnek a bakteriális kromoszómába, ami azonnal biztosítja a genetikai anyag jelentős fragmentumának hozzáadását (82. ábra). A bakteriális kromoszómába beilleszthető és onnan kivágható plazmidokat episzómáknak nevezzük. Néha az episzóma kivágása más IS-elempárnál is előfordulhat, mint amelyen keresztül az integráció megtörtént. Ebben az esetben a plazmid képes befogni a kromoszómaanyag egy részét és a DNS egy részét
Módosított Tn5 transzpozont és integrált toxin gént hordozó plazmidot vittek be egy baktériumba, amelynek kromoszómális DNS-ébe a vad típusú Tn5 transzpozont inszertálták.
Számos baktériumban találtak nem kromoszómális genetikai plazmid elemeket, mérsékelt égövi fágokat és vándorló elemeket (transzpozonokat és 15 elemeket). A plazmidokat a nem kromoszómális állapotban való stabil létezés jellemzi. A transzpozonok és a 15-elemek általában a kromoszómák részét képezik, de képesek a kromoszómáról a plazmidba átvinni, ezért a nem kromoszómális genetikai elemek közé is besorolhatók.
A transzpozonok markereként szolgálhatnak a klónozásra szánt génekhez. Mint ismeretes, a baktériumok kromoszómális génjeinek klónozása során néha nehézségek adódnak abból a tényből adódóan, hogy nincs egyszerű módszer annak meghatározására, hogy a kromoszómális DNS integrált fragmentumát hordozó plazmidok közül melyik tartalmazza a kutató számára érdekes gént. Néha ez a probléma megoldható úgy, hogy először izolálunk egy mutánst ehhez a génhez egy benne lévő vagy a közelben található transzpozonnal.
A prokarióta és eukarióta sejtek kromoszómális DNS-ében megtalálhatók a kontroll vagy úgynevezett „ugró” mobil gének - transzpozonok (Tn), amelyeket először B McClintock fedezett fel 1940-ben kukoricában, amelyek jelentős távolságra helyezkednek el a többi géntől, amelyekre hatással vannak mutációk, úgynevezett „transzpozon-robbanások”, genetikai elemek masszív és bizonyos mértékig irányított mozgása lehetséges. (mag DNS) A baktériumokban a transzpozonok túlnyomó része egy enzimet kódol
5.1. A bakteriális genom felépítése
Az örökletes információt a baktériumok DNS-nukleotidok szekvenciája formájában tárolják, amelyek meghatározzák a fehérjében lévő aminosavak szekvenciáját (a DNS szerkezetét a 3.1. szakasz vázolja, és a 3.1. ábra mutatja).
Minden fehérjének megvan a maga génje, pl. egy diszkrét régió a DNS-en, amely a nukleotidszekvencia számában és specifitásában különbözik.
A baktériumok összes génjének gyűjteményét genomnak nevezzük. A genom méretét a nukleotid bázispárok (bp) száma határozza meg. A bakteriális genom haploid génkészlettel rendelkezik. A bakteriális genom önálló replikációra (reprodukcióra) képes genetikai elemekből áll, pl. replikonok. A replikonok a bakteriális kromoszóma és a plazmidok.
5.1.1. Bakteriális kromoszóma
A bakteriális kromoszómát egy kétszálú DNS-molekula képviseli. A bakteriális kromoszóma méretei a domén különböző képviselőiben Procaryotae változnak. Például at E. coli a bakteriális kromoszóma 4,7x10 6 bp-t tartalmaz. Körülbelül 4300 gént tartalmaz. Összehasonlításképpen: a vírus DNS mérete körülbelül 10 3 bp, az élesztő - 10 7 bp, a humán kromoszómális DNS teljes hossza pedig 3x10 9 bp.
Bakteriális kromoszóma E. coli 1 kör alakú DNS-molekula képviseli. Számos más baktériumnak is van egy gyűrűs kromoszómája: Shigella spp, Salmonella spp, P. aeruginosa, B. subtilus. Ez a genomszerkezet azonban nem univerzális. Egyes baktériumokban, különösen V. cholerae, L. interrhogans, Brucella spp., van
Két gyűrűs kromoszóma van. Számos más baktériumban (B. burgdorferi, Streptomyces spp.) Lineáris kromoszómákat fedeztek fel.
A bakteriális kromoszóma a baktériumsejt kompakt nukleoidját alkotja. A baktériumsejt számára létfontosságú funkciókat kódol.
5.1.2. Bakteriális plazmidok
A plazmidok kétszálú DNS-molekulák, amelyek mérete 10 3 és 10 6 bp között van. Lehetnek gyűrű alakúak vagy lineárisak. A plazmidok olyan funkciókat kódolnak, amelyek nem nélkülözhetetlenek a baktériumsejt életéhez, de előnyöket biztosítanak a baktériumoknak, ha kedvezőtlen életkörülményeknek vannak kitéve.
A plazmidok által a baktériumsejtnek tulajdonított fenotípusos jellemzők között a következők találhatók:
Antibiotikum rezisztencia;
Patogenitási tényezők előállítása;
Antibiotikus anyagok szintetizálásának képessége;
colicinek képződése;
Összetett szerves anyagok lebontása;
Restrikciós és módosító enzimek kialakulása. A plazmid replikációja a c kromoszómától függetlenül történik
ugyanazon enzimcsoport részvétele, amely a bakteriális kromoszóma replikációját végzi (lásd 3.1.7. fejezet és 3.5. ábra).
Egyes plazmidok szigorú ellenőrzés alatt állnak. Ez azt jelenti, hogy replikációjuk a kromoszóma replikációjával párosul, így minden baktériumsejt egy vagy legalább több plazmidmásolatot tartalmaz.
A gyenge kontroll alatt álló plazmidok kópiáinak száma baktériumsejtenként elérheti a 10-200 példányt.
A plazmid replikonok jellemzésére általában kompatibilitási csoportokra osztják őket. A plazmid-inkompatibilitás azzal jár, hogy két plazmid nem képes stabilan megmaradni ugyanabban a baktériumsejtben. Az inkompatibilitás azokra a plazmidokra jellemző, amelyek replikonjai nagy hasonlósággal rendelkeznek, és amelyeknek a sejtben való fenntartását ugyanaz a mechanizmus szabályozza.
A bakteriális kromoszómába reverzibilisen beépülő és egyetlen replikonként működő plazmidokat ún. integráló vagy epizómák.
Az egyik sejtből a másikba átvihető, esetenként akár eltérő taxonómiai egységhez tartozó plazmidokat ún. átvihető (konjugatív) A transzmissibilitás csak a nagy plazmidokban rejlik, amelyekben van egy tra-operon, amely egyesíti a plazmidtranszferért felelős géneket. Ezek a gének nemi pilusokat kódolnak, amelyek hidat képeznek egy átvihető plazmidot nem tartalmazó sejttel, amelyen keresztül a plazmid DNS átkerül egy új sejtbe. Ezt a folyamatot ún konjugáció(részletesen az 5.4.1. pontban lesz szó róla). Az átvihető plazmidokat hordozó baktériumok érzékenyek a „hím” fonalas bakteriofágokra.
Azok a kis plazmidok, amelyek nem hordoznak tra géneket, önmagukban nem továbbíthatók, de képesek transzmisszióra alkalmas plazmidok jelenlétében a konjugációs berendezésük segítségével. Az ilyen plazmidokat ún mozgósított,és maga a folyamat - mozgósítás nem átvihető plazmid.
Az orvosi mikrobiológiában különösen fontosak azok a plazmidok, amelyek bakteriális rezisztenciát biztosítanak az antibiotikumokkal szemben, amelyeket R-plazmidoknak (angolul. ellenállás - ellenhatás), valamint olyan plazmidok, amelyek biztosítják a patogenitási faktorok termelését, amelyek hozzájárulnak a fertőző folyamat kialakulásához a makroorganizmusban. Az R-plazmidok olyan géneket tartalmaznak, amelyek meghatározzák az antibakteriális gyógyszereket (például antibiotikumok) elpusztító enzimek szintézisét. Egy ilyen plazmid jelenléte következtében a baktériumsejt rezisztenssé (rezisztenssé) válik egy egész gyógyszercsoport, és néha több gyógyszer hatásával szemben is. Sok R-plazmid átvihető, elterjed a baktériumpopulációban, így elérhetetlen az antibakteriális gyógyszerek hatásai számára. Az R-plazmidokat hordozó baktériumtörzsek nagyon gyakran a nozokomiális fertőzések etiológiai ágensei.
A patogenitási faktorok szintézisét meghatározó plazmidokat mára számos olyan baktériumban találtak, amelyek emberi fertőző betegségek kórokozói. A shigellosis, yersiniosis, pestis, lépfene, ixodid borelliosis és intestinalis escherichiosis kórokozóinak patogenitása patogenitási plazmidok jelenlétével és működésével függ össze.
Egyes baktériumsejtek olyan plazmidokat tartalmaznak, amelyek meghatározzák a baktériumölő szerek szintézisét más baktériumokkal szemben.
anyaggödrök. Például néhány E. coli Col plazmiddal rendelkeznek, amely meghatározza a colicinek szintézisét, amelyek mikrobicid hatással rendelkeznek a coliform baktériumok ellen. Az ilyen plazmidokat hordozó baktériumsejtek előnyökkel járnak az ökológiai rések kolonizálásában.
A plazmidokat az emberi gyakorlatban használják, különösen a génsebészetben olyan speciális rekombináns baktériumtörzsek felépítésében, amelyek nagy mennyiségű biológiailag aktív anyagot termelnek (lásd a 6. fejezetet).
5.1.3. Mobil genetikai elemek
A mobil genetikai elemek a bakteriális genomban megtalálhatók mind a bakteriális kromoszómában, mind a plazmidokban. A mobil genetikai elemek közé tartoznak az inszerciós szekvenciák és a transzpozonok.
Beszúrás (beszúrási) sorozatok - IS elemek (angolból. beillesztési szekvenciák)- ezek olyan DNS-szakaszok, amelyek egészében képesek mozogni a replikon egyik szakaszából a másikba, valamint a replikonok között. Az IS elemek 1000 bp méretűek. és csak azokat a géneket tartalmazzák, amelyek saját mozgásukhoz - transzpozíciójukhoz szükségesek: a transzpozáz enzimet kódoló gént, amely biztosítja az IS elem DNS-ből való kizárásának folyamatát és új lókuszba való beépülését, valamint egy gént, amely meghatározza a transzpozáz enzim szintézisét. represszor, amely a mozgás teljes folyamatát szabályozza. Ezeket a géneket szegélyezik fordított ismétlődések amelyek rekombinációs helyekként szolgálnak, amelyek az inszerciós szekvencia mozgását kísérik transzpozíciós enzimek, különösen transzpozázok részvételével.
Az invertált ismétlődéseket a transzpozáz enzim ismeri fel (5.1. ábra), amely a transzponálható elem két oldalán elhelyezkedő DNS-szálakban egyszálú töréseket hajt végre. Az IS elem eredeti példánya ugyanazon a helyen marad, és a replikált másolata átkerül az új helyre.
A mobil genetikai elemek mozgását általában replikatív vagy illegitim rekombinációnak nevezik. A bakteriális kromoszómákkal és a plazmidokkal ellentétben azonban a mobil genetikai elemek nem független replikonok,
Rizs. 5.1. Az IS elem szerkezetének vázlata: 1 - represszor gén; 2 - transzpozáz gén; nyilak jelzik a szakadás helyeit
mivel replikációjuk szerves eleme annak a replikonnak a DNS-replikációjának, amelyben elhelyezkednek.
Az IS elemek mérete, típusa és a fordított ismétlődések száma eltérő.
Transzpozonok - Ezek olyan DNS-szakaszok, amelyek tulajdonságai megegyeznek az IS elemekkel, de tartalmaznak szerkezeti géneket, pl. olyan gének, amelyek olyan molekulák szintézisét biztosítják, amelyek specifikus biológiai tulajdonsággal, például toxicitással rendelkeznek, vagy rezisztenciát biztosítanak az antibiotikumokkal szemben.
A mobil genetikai elemek replikon mentén vagy replikonok között történő mozgása a következőket okozza:
A DNS azon szakaszainak génjeinek inaktiválása, ahol azok elmozdulásuk után integrálódtak;
A genetikai anyag károsodásának kialakulása;
Replikon fúzió, i.e. a plazmid integrálása a kromoszómába;
A baktériumpopulációban a gének elterjedése, amely a populáció biológiai tulajdonságainak megváltozásához, a fertőző betegségek kórokozóinak megváltozásához vezethet, valamint hozzájárul a mikrobák közötti evolúciós folyamatokhoz.
5.1.4. Integronok
A plazmidokon és a mobil genetikai elemeken kívül a baktériumoknak van egy másik rendszere is, amely elősegíti a gének terjedését - az integron rendszer. Integronokún. kis DNS-elemek rögzítésére szolgáló rendszer génkazetták, helyspecifikus rekombináció és expressziójuk révén.
Az integron egy konzervált régióból áll, amely az 5" végén található, és tartalmazza az integráz enzimet kódoló gént, egy rekombinációs helyet. attés P promoter (5.2. ábra).
A kazetta két formában létezhet: lineáris, amikor a kazetta egy integronba integrálódik, és egy kis, körkörös kétszálú DNS formájában. A kazetták mérete 260 és 1500 bp között van. Túlnyomórészt 1 antibiotikum rezisztencia gént és egy 59 bázispárból álló rekombinációs helyet tartalmaznak a 3" végén.
Az Integrase rekombinációt hajt végre az 59 bp hosszúságú hely között. kazetták és cselekmény att integron, amely a kazettás géneket olyan orientációban építi be az integronba, hogy azok a P integron promoterből expresszálódjanak. A kazetták integronba integrálása megfordítható folyamat. Az integronok a kromoszómán és a plazmidokon egyaránt elhelyezkedhetnek. Ezért lehetséges, hogy a kazetták egyik integronról a másikra mozogjanak, mind az egyik baktériumsejten belül, mind az egész baktériumpopulációban. Egyetlen integron több antibiotikum-rezisztencia-kazettát is rögzíthet. Változtatások
Rizs. 5.2. Integron szerkezet: attI- integron rekombinációs hely; intI- integrázt kódoló gént; P - promoter; attC- az antibiotikum rezisztencia kazetták rekombinációs helyei
A bakteriális genom, és így a baktériumok tulajdonságai mutációk és rekombinációk eredményeként jelentkezhetnek.
5.1.5. A patogenitás szigetei
A kórokozó baktériumok genomjában (lásd a 8. fejezetet) legalább 10 000 nukleotidpár hosszúságú DNS szakaszok találhatók, amelyek G-C nukleotid bázispárok összetételében különböznek a fő genomtól. Ezek a területek felelősek a patogenitási faktorok szintéziséért, amelyek biztosítják a kóros folyamat kialakulását a gazdaszervezetben, ezért nevezték őket patogenitási szigeteknek. A patogenitási szigeteket általában DNS-szekvenciák vagy IS-elemek közvetlen ismétlődései szegélyezik. Néhányan a tRNS gének közelében található integrációs helyekre jellemző régiókat tartalmaznak. A legtöbb patogenitási sziget a bakteriális kromoszómán található (szalmonella), de lehetnek plazmidok is (Sigella)és fág DNS (V. cholerae O1, O139).
5.2. Mutációk a baktériumokban
A mutációk az egyes DNS-nukleotidok szekvenciájában bekövetkező változások, amelyek fenotípusosan olyan megnyilvánulásokhoz vezetnek, mint a baktériumsejt morfológiájának megváltozása, növekedési faktorok, például aminosavak, vitaminok, pl. auxotrófia, antibiotikum-rezisztencia, hőmérséklet-érzékenység változása, csökkent virulencia (attenuáció) stb.
A funkcióvesztést okozó mutációt közvetlen mutációnak nevezzük. A mutánsok megtapasztalhatják eredeti tulajdonságaik helyreállítását, pl. reverzió (angolból. fordított - vissza). Ha az eredeti genotípust helyreállítják, akkor a genotípust és fenotípust visszaállító mutációt reverznek vagy direktnek nevezzük. visszafordítás. Ha egy mutáció visszaállítja a fenotípust a genotípus helyreállítása nélkül, akkor egy ilyen mutációt nevezünk elnyomó. A szupresszor mutációk előfordulhatnak ugyanazon a génen belül, amelyben az elsődleges mutáció előfordult, és más génekben is, vagy a tRNS mutációihoz is társulhatnak.
A DNS-károsodás változásának mértéke alapján pontmutációkat különböztetünk meg, amikor a károsodás egyre korlátozódik
egy pár nukleotid, és kiterjesztett vagy aberrációk. Utóbbi esetben több nukleotidpár elvesztése is megfigyelhető, amelyeket ún törlés, nukleotidpárok összeadása, azaz. párhuzamosságok a kromoszóma fragmentumok mozgása, transzlokációkés a nukleotidpárok átrendeződése - inverziók.
Lehetnek mutációk spontán, azaz. spontán, külső hatás nélkül keletkező, és indukált.
Pont spontán A mutációk a DNS-replikáció során fellépő hibák következtében lépnek fel, ami az elektronok nitrogénbázisokban történő tautomer mozgásához kapcsolódik.
A timin (T) például általában keto formában fordul elő, amelyben hidrogénkötést képes kialakítani az adeninnel (A). De ha a timin a DNS-replikáció során a bázispárosodás során enol formává alakul, akkor párosodik a guaninnal. Ennek eredményeként az új DNS-molekulában egy G-C pár jelenik meg azon a helyen, ahol az A-T pár korábban állt.
A spontán kromoszóma-rendellenességek a mobil genetikai elemek mozgása miatt keletkeznek. Az indukált mutációk külső tényezők hatására jelennek meg, amelyeket ún mutagéneket. A mutagének fizikai (UV-sugárzás, γ-sugárzás), kémiai (purin- és pirimidinbázisok, salétromsav és analógjai és egyéb vegyületek analógjai) és biológiai - transzpozonok.
A purin és pirimidin bázisok analógjai, például a 2-aminopurin, az 5-bromouracil, megtalálhatók a nukleotidokban, így a DNS-ben is, de sokkal valószínűbb, hogy a tautomer átalakulások miatt „rossz” partnerekkel párosulnak, ami a sejtek helyettesítését eredményezi. egy purint egy másik purinnal (A-D) vagy pirimidint egy másik pirimidinnel (T-C). Egy purin helyettesítését egy másik purinnal és egy pirimidint egy másik pirimidinnel nevezik átmenet.
A salétromsav és analógjai a nitrogéntartalmú bázisok dezaminációját okozzák, ami a párosítás során hibákat és ennek következtében átmenetet eredményez. Az adenin a dezamináció eredményeként hipoxantinná alakul, ami a citozinnal párosul, ami AT-GC átmenethez vezet. A guanin dezaminálva xantinná alakul, amely még mindig párosul a citozinnal; így a guanin dezaminálása nem jár mutációval.
Akridin és proflavin kerül a DNS-lánc szomszédos bázisai közé, megkétszerezve a köztük lévő távolságot. Ez a térbeli változás a replikáció során vagy egy nukleotid elvesztéséhez vagy egy további nukleotidpár felvételéhez vezethet, ami olvasási keretváltás tRNS. Az információ olvasása hibásan attól a helytől kezdve, ahol egy nukleotid elvesztése vagy felvétele történt.
Az UV-sugárzás túlnyomórészt a pirimidinbázisokra hat, és két szomszédos DNS-timin-maradék kovalensen kapcsolódhat.
UV-sugárzásnak kitett baktériumok esetében kimutatták, hogy a besugárzás által okozott károsodás a bakteriális DNS-ben részben korrigálható a jóvátétel rendszerek A különböző baktériumoknak többféle javítórendszerük van. A javítás egyik típusa fényben történik, és egy fotoreaktiváló enzim aktivitásához kapcsolódik, amely hasítja a timin dimert. A sötét javítás során a DNS-lánc hibás szakaszait eltávolítják, és a keletkező rést a fennmaradó lánc templátán lévő DNS-polimeráz segítségével kiegészítik, és ligázzal kapcsolják a lánchoz.
5.3. Rekombináció baktériumokban
A genetikai rekombináció két különböző genotípusú DNS közötti kölcsönhatás, amelynek eredményeként olyan rekombináns DNS képződik, amely mindkét szülő génjeit egyesíti.
A baktériumokban a rekombináció jellemzőit az ivaros szaporodás és a meiózis hiánya határozza meg, amely során a magasabb rendű szervezetekben rekombináció és haploid génkészlet fordul elő. A rekombináció során a baktériumokat hagyományosan donorsejtekre osztják, amelyek genetikai anyagot továbbítanak, és recipiens sejtekre, amelyek megkapják azt. A donor sejt kromoszómájának nem mindegyike, hanem csak egy része hatol be a befogadó sejtbe, ami egy hiányos zigóta kialakulásához vezet - merozigóták. A rekombináció eredményeként a merozigótában csak egy rekombináns képződik, melynek genotípusát főként a recipiens genotípusa képviseli, benne a donor kromoszóma egy fragmentumával. Reciprok rekombinánsok nem képződnek.
A molekuláris mechanizmus szerint a baktériumok genetikai rekombinációja homológra, helyspecifikusra és illegitimre oszlik.
5.3.1. Homológ rekombináció
A homológ rekombináció során a DNS-törés és újraegyesítés folyamata során csere megy végbe a nagyfokú homológiával rendelkező DNS-régiók között. A homológ rekombináció folyamata az egyesített gének irányítása alatt áll R.E.C.- génekből álló rendszer recA, B, C, D. Ezeknek a géneknek a termékei letekerik a DNS-szálakat, és átirányítják őket, hogy létrehozzák a hemichiasmát, a Holiday struktúrát, valamint a Holiday struktúrát is levágják a rekombinációs folyamat befejezéséhez.
5.3.2. Helyspecifikus rekombináció
Az ilyen típusú rekombináció nem függ a gének működésétől recA, B, C, D, nem igényel kiterjesztett DNS-homológia szakaszokat, de ennek lefolyásához szigorúan meghatározott DNS-szekvenciák és speciális enzimatikus apparátus szükséges, amely minden konkrét esetre jellemző. Az ilyen típusú rekombinációra példa a plazmid integrációja egy bakteriális kromoszómába, amely a kromoszóma és a plazmid azonos IS elemei között történik, valamint a lambda fág DNS integrációja a kromoszómába. E. coli. Az egy replikonon belül előforduló helyspecifikus rekombináció szintén részt vesz a génaktivitás váltásában. Például Salmonellában ennek a folyamatnak a következménye a flagelláris H-antigén fázisváltozásai.
5.3.3. Illegitim vagy replikatív rekombináció
Az illegitim vagy replikatív rekombináció nem függ a génfunkciótól recA, B, C, D. Példa erre a mobil genetikai elemek replikon mentén vagy replikonok között történő transzpozíciója, míg, amint azt az 5.1.3. szakaszban már említettük, egy mobil genetikai elem transzpozícióját DNS-replikáció kíséri.
A baktériumokban történő rekombináció a genetikai anyag baktériumok közötti átvitelének utolsó szakasza, amely három mechanizmussal megy végbe: konjugáció (a baktériumok érintkezése,
amelyek közül az egyik konjugatív plazmidot hordoz), transzdukció (bakteriofág használatával), transzformáció (nagyon polimerizált DNS felhasználásával).
5.4. Genetikai információ átvitele baktériumokban5.4.1. Konjugáció
A genetikai anyag donor sejtből a recipiens sejtbe történő átvitelét közvetlen sejtkontaktussal konjugációnak nevezik, amelyet először J. Lederberg és E. Tatum fedezett fel 1946-ban.
A konjugáció szükséges feltétele egy átvihető plazmid jelenléte a donor sejtben. Az átvihető plazmidok nemi pilusokat kódolnak, amelyek konjugációs csövet képeznek a donor sejt és a recipiens sejt között, amelyen keresztül a plazmid DNS átkerül az új sejtbe. A plazmid DNS sejtről sejtre történő átvitelének mechanizmusa az, hogy a tra operon által kódolt speciális fehérje felismer egy specifikus szekvenciát a plazmid DNS-ben (úgynevezett plazmid DNS). eredet - eleje), egyszálú törést vezet be ebbe a szekvenciába, és kovalensen kötődik az 5"-os véghez. Ezután a DNS-szál, amelyhez a fehérje kötődik, átkerül a recipiens sejtbe, és a töretlen komplementer szál a donor sejtben marad. A DNS-szintézis sejtes apparátusa mind a donorban, mind a recipiensben az egyszálakat kettős szálú szerkezetté teszi. Az átvitt lánc 5"-os végéhez kapcsolódó fehérje hozzájárul a plazmid gyűrűbe zárásához a fogadó sejtben . Ez a folyamat az ábrán látható. 5.3, és az F plazmid recipiens sejtbe történő átvitelének példájával (angol nyelvből. termékenység - fertilitás), amely egyben átvihető és integratív plazmid is. Az F-faktorral rendelkező donorsejteket F+-sejteknek, az F-faktorral nem rendelkező recipiens sejteket pedig F-sejteknek nevezzük. Ha az F faktor autonóm állapotban van a donor sejtben, akkor az F + * F keresztezés eredményeként a recipiens sejt donor tulajdonságokat szerez.
Ha egy donor sejt kromoszómájába F-faktort vagy más transzmissziós plazmidot inszertálnak, akkor a plazmid és a kromoszóma egyetlen transzmissziós replikonként kezd működni, ami lehetővé teszi a bakteriális gének plazmamentes sejtekbe történő átvitelét.
Rizs. 5.3. A konjugáció sémája baktériumokban: a - F plazmid átvitele F + - sejtből F - sejtbe; b - bakteriális kromoszóma átvitele Hfr* F-
középső befogadó sejt, azaz konjugációs folyamat. Azok a törzsek, amelyekben a plazmid integrált állapotban van, nagy gyakorisággal adják át kromoszómális génjeit plazmidmentes sejtekbe, ezért ún. Hfr(angolról magas frekvencia nak,-nek rekombináció - magas rekombinációs frekvencia) (5.3. ábra, b).
A kromoszómális gének átvitelének folyamata keresztezés esetén Hfrχ F - mindig ugyanazon a ponton kezdődik a DNS hasításával - az F faktor vagy más átvihető plazmid integrációjának helyén. A donor DNS egyik szála egy konjugációs hídon keresztül kerül a recipiens sejtbe. A folyamatot a komplementer szál kiteljesedése egy kétszálú szerkezet kialakulásáig kíséri. A kromoszómális gének átvitele a konjugáció során mindig azonos irányú, ellentétes a beépített plazmiddal. Maga az átvihető plazmid kerül átadásra utoljára. A donor DNS-szál, amelyet átvittek a recipiens sejtbe, és kettős szálú szerkezetté egészülnek ki, rekombinálódik a recipiens DNS homológ régiójával, hogy stabil genetikai szerkezetet hozzon létre. A konjugációs híd törékenysége miatt a nemi faktor ritkán kerül át a recipiens sejtbe, ezért a kapott rekombináns általában nem rendelkezik donor funkcióval.
A géntranszfer irányultsága miatt a konjugációt a bakteriális genom feltérképezésére és a genetikai térkép felépítésére használják.
5.4.2. Transzdukció
A transzdukció a bakteriális DNS átvitele bakteriofágon keresztül. Ezt a folyamatot 1951-ben N. Zinder és J. Lederberg fedezte fel. A baktériumon belüli fágreplikáció folyamata során (lásd a 3.3. pontot) a bakteriális DNS-fragmens bejut a fágrészecskébe, és a fágfertőzés során átkerül a befogadó baktériumba. Kétféle transzdukció létezik: Tábornok transzdukció - a bakteriális kromoszóma bármely részének egy szegmensének bakteriofág általi átvitele - annak a ténynek köszönhető, hogy a fágfertőzés során a bakteriális DNS feldarabolódik, és a fág DNS-ével azonos méretű bakteriális DNS-fragmens behatol a fágba. fej, hibás fágrészecskét képezve. Ez a folyamat körülbelül 1/1000 fágrészecske gyakorisággal megy végbe (5.4. ábra, a). Ha egy recipiens sejtet hibás fágrészecskével fertőznek meg, a donor sejt DNS-ét „injektálják” bele, és homológ rekombinációval rekombinálódik a recipiens kromoszóma homológ régiójával, hogy stabil rekombinánst hozzon létre. A P-fágok rendelkeznek ilyen típusú transzdukcióval. Különleges A transzdukció akkor következik be, amikor a fág DNS integrálódik a bakteriális kromoszómába, és profágot képez. A DNS-fág bakteriális kromoszómából való kizárásának folyamata során egy véletlenszerű folyamat eredményeként a bakteriális kromoszóma egy, a fág DNS beépülési helyével szomszédos fragmentumot befogják, amely hibás fággá válik (5.4. ábra, b). Mivel a legtöbb mérsékelt égövi bakteriofág bizonyos területeken beépül a bakteriális kromoszómába, az ilyen bakteriofágokra jellemző, hogy a bakteriális DNS egy bizonyos szakaszát a donor sejtből a befogadó sejtbe továbbítják. A hibás fág DNS-e helyspecifikus rekombinációval rekombinálódik a befogadó sejt DNS-ével. A rekombináns a bejuttatott génnek köszönhetően merodiploiddá válik. Különösen a bakteriofág viszi át a gal gént a E. coli.
Rizs. 5.4. Transzdukciós séma: a - nem specifikus (általános); b - specifikus
5.4.3. átalakítás
Az átalakulás jelenségét először 1928-ban írta le F. Griffiths, aki felfedezte a pneumococcusok akapszuláris R-törzsének átalakulását. (Streptococcus pneumoniae) S-alakú kapszulát képező törzsbe. Griffiths egyidejűleg injektált egereket kis számú avirulens R-sejtekkel és hővel elölt S-sejtekkel. Az R sejteket egy olyan törzsből nyertük, amelynek tokanyaga az S II típusba tartozott, a hővel elölt S törzsek pedig az S III típusba tartoztak. Virulens pneumococcusokat S III kapszulával izoláltunk elhullott egerek véréből.
1944-ben O. Avery, K. McLeod és M. McCarthy meghatározta a transzformáló faktor természetét, bemutatva, hogy a kapszulázott pneumococcusokból kivont DNS képes a kapszulázatlan pneumococcusokat tokozott formává alakítani. Így bebizonyosodott, hogy a DNS a genetikai információ hordozója.
Az átalakulási folyamat spontán módon megtörténhet a természetben egyes baktériumfajokban, B. subtilis, H. influenzae, S. pneumoniae, amikor az elhalt sejtekből kivont DNS-t a befogadó sejtek felveszik. A transzformációs folyamat a recipiens sejt kompetenciájától és a donor transzformáló DNS állapotától függ. Kompetencia - ez lehetséges
a baktériumsejt DNS-elnyelő képessége. Ez attól függ, hogy a sejtmembránban vannak-e speciális fehérjék, amelyek specifikus affinitást mutatnak a DNS-hez. A Gram-pozitív baktériumok kompetenciájának állapota a növekedési görbe bizonyos fázisaihoz kapcsolódik. A Gram-negatív baktériumok illetékességi állapotát mesterségesen kell létrehozni, a baktériumok hő- vagy áramütésnek kitéve.
Csak a kétszálú, erősen helikális DNS-molekula rendelkezik transzformáló aktivitással. Ennek az az oka, hogy a DNS-nek csak az egyik szála hatol be a befogadó sejtbe, míg a másik - a sejtmembránon - lebomlik az energia felszabadulásával, ami szükséges ahhoz, hogy a fennmaradó szál behatoljon a sejtbe. A transzformáló DNS nagy molekulatömege növeli a rekombináció esélyét, mivel a sejten belül a transzformáló DNS-szál endonukleázoknak van kitéve. A kromoszómával való integráció megköveteli a vele homológ régiók jelenlétét a transzformáló DNS-ben. A rekombináció az egyik szálon megy végbe, melynek eredményeként egy heteroduplex molekula képződik, amelynek egyik szála a recipiens genotípust, a másik pedig a rekombináns genotípust tartalmazza. A rekombináns transzformánsok csak a replikációs ciklus után keletkeznek (5.5. ábra).
Jelenleg ez a módszer a géntechnológia fő módszere, amelyet adott genommal rendelkező rekombináns törzsek felépítésében alkalmaznak.
Rizs. 5.5.Átalakítási séma
5.5. A vírusgenetika jellemzői
A vírusgenom szerkezetének sajátossága, hogy a vírus típusától függően mind a DNS-en, mind az RNS-en rögzíthetők az örökletes információk.
A vírusok mutációi spontán módon is létrejöhetnek a vírus nukleinsavának replikációja során, valamint ugyanazon külső tényezők és mutagének hatására, mint a baktériumokban.
Fenotipikusan a vírusgenom mutációi az antigén szerkezet változásaiban, az érzékeny sejtben nem képesek produktív fertőzést okozni, a termelési ciklus hőmérsékletre való érzékenységében, valamint a vírusok által okozott plakkok alakjában és méretében jelentkeznek. sejttenyészetben agar bevonat alatt alakulnak ki (lásd a 3.2. fejezetet).
A vírusok tulajdonságai megváltozhatnak, ha egy érzékeny sejtet egyidejűleg több vírus fertőz meg, és ilyen körülmények között a tulajdonságok megváltozhatnak mind a különböző vírusokhoz tartozó nukleinsav-anyagok közötti csere (genetikai rekombináció és genetikai reaktiváció), mind a nem folyamatok eredményeként. a genetikai anyag cseréje (komplementáció és fenotípusos keveredés) kíséri.
Genetikai rekombináció gyakrabban fordul elő DNS-tartalmú vírusokban. Az RNS-vírusok közül azokban figyelhető meg, amelyeknek töredezett genomjuk van, például az influenzavírusban. A rekombináció során csere történik a genom homológ régiói között.
Genetikai reaktiváció a különböző génekben mutációkat tartalmazó rokon vírusok genomja között megfigyelhető. A genetikai anyag újraelosztása következtében teljes értékű leánygenom alakul ki.
Kiegészítés akkor fordul elő, ha a sejtet megfertőző két vírus egyike mutáció eredményeként nem működő fehérjét szintetizál. Egy nem mutáns vírus, amely egy teljes fehérjét szintetizál, kompenzálja annak hiányát a mutáns vírusban.
Fenotípusos keveredés akkor figyelhető meg, amikor egy érzékeny sejt két vírussal keveredik, az utódok egy része a két vírusban rejlő fenotípusos jellemzőket szerez, miközben ugyanazt a genotípust megtartja.
5.6. Genetikai módszerek alkalmazása fertőző betegségek diagnosztizálásában
A genetikai módszereket gyakorlati célokra alkalmazzák mind a mikroba kimutatására a vizsgált anyagban tiszta tenyészet izolálása nélkül, mind a mikroba taxonómiai helyzetének meghatározására és az intraspecifikus azonosításra.
5.6.1. A baktériumok intraspecifikus azonosítására használt módszerek
A restrikciós elemzés az úgynevezett enzimek használatán alapul restrikciós enzim A restrikciós enzimek olyan endonukleázok, amelyek DNS-molekulákat hasítanak el úgy, hogy nem véletlenszerű helyeken, hanem meghatározott nukleotidszekvenciákban bontják fel a foszfátkötéseket. A molekuláris genetika módszerei szempontjából különösen fontosak a restrikciós enzimek, amelyek felismerik a centrális szimmetriájú szekvenciákat, és mindkét irányban egyformán olvashatók a szimmetriatengelyről. A DNS töréspontja vagy egybeeshet a szimmetriatengellyel, vagy ahhoz képest eltolódhat.
Jelenleg több mint 175 különböző restrikciós enzimet izoláltak és tisztítottak meg különböző baktériumokból, amelyek felismerési (restrikciós) helyei (helyek) ismertek. Több mint 80 különböző típusú helyet azonosítottak, ahol a DNS kettős hélix megszakadhat. Egy adott taxonómiai egység genomja szigorúan meghatározott (genetikailag meghatározott) számú felismerési helyet tartalmaz egy adott restrikciós enzim számára. Ha egy adott mikrobából izolált DNS-t egy bizonyos restrikciós enzimmel kezelnek, ez szigorúan meghatározott számú, rögzített méretű DNS-fragmens képződéséhez vezet. Az egyes fragmenstípusok mérete agaróz gélelektroforézissel határozható meg: a kis fragmentumok gyorsabban haladnak át a gélen, mint a nagyobbak, és hosszabb az úti távolságuk. A gélt etidium-bromiddal megfestjük, és UV-fényben fényképezzük. Ily módon egy bizonyos típusú mikrobáról kaphat restrikciós térképet.
A különböző törzsekből izolált DNS restrikciós térképeinek összehasonlításával meghatározható genetikai kapcsolatuk, azonosítható egy adott fajhoz vagy nemzetséghez való tartozás, valamint kimutatható.
mutációnak kitett élő területek. Ezt a módszert alkalmazzák a nukleotidpárok szekvenciáját meghatározó módszer (szekvenálás) és a molekuláris hibridizációs módszer kezdeti szakaszaként is.
Baktériumok plazmidprofiljának meghatározása. A plazmid profil lehetővé teszi a baktériumok intraspecifikus azonosítását. Ehhez a baktériumsejtből plazmid DNS-t izolálnak, amelyet elektroforézissel agaróz gélben választanak el, hogy meghatározzák a plazmidok számát és méretét.
Ribotipizálás. Az rRNS-t kódoló operonokban a nukleotidbázisok szekvenciáját egyaránt jellemzi az evolúció során kisebb változásokon átesett, különböző baktériumokban hasonló szerkezetű konzervatív régiók, valamint a genetikai markerek gén- és fajspecifikus variábilis szekvenciái. azonosítás. Ezek az operonok több példányban is jelen vannak a bakteriális kromoszómán. A restrikciós enzimekkel történő feldolgozás után kapott DNS-fragmensek olyan rRNS génszekvenciákat tartalmaznak, amelyek molekuláris hibridizációval kimutathatók a megfelelő baktériumfajok jelölt rRNS-ével. Az rRNS-operonok kópiáinak száma és elhelyezkedése, valamint a restrikciós helyek összetétele mind az rRNS-operonon belül, mind annak oldalai mentén a különböző baktériumfajok között változik. A módszer ezen a tulajdonságon alapul ribotipizálás, amely lehetővé teszi az izolált törzsek monitorozását és típusuk meghatározását. Jelenleg a ribotipizálás speciális eszközökön automatikusan történik.
5.6.2. Mikrobák kimutatására használt módszerek anélkül, hogy tiszta tenyészetté izolálnák
A molekuláris hibridizációs módszer lehetővé teszi a különböző DNS-ek közötti hasonlóság mértékének meghatározását. A mikrobák azonosításában használják pontos taxonómiai helyzetük meghatározására, valamint a mikroba kimutatására a vizsgált anyagban anélkül, hogy tiszta tenyészetté izolálnák. A módszer azon alapul, hogy a kettős szálú DNS képes emelt hőmérsékleten (90 °C) lúgos környezetben denaturálódni, pl. bontsa ki két szálra, és amikor a hőmérséklet 10 °C-kal csökken, állítsa vissza újra az eredeti kettős láncú szerkezetet. A módszerhez molekuláris szondára van szükség.
Szonda radioaktív nuklidokkal, enzimmel vagy fluorokróm festékkel jelölt egyszálú nukleinsavmolekula, amellyel a vizsgált DNS-t összehasonlítják.
A molekuláris hibridizáció végrehajtásához a vizsgált DNS-t a fent leírt módon felbontják, az egyik szálat speciális szűrőn rögzítik, majd egy próbát tartalmazó oldatba helyezik. Olyan feltételek jönnek létre, amelyek kedvezőek a kettős hélixek kialakulásához. Ha a próba és a vizsgált DNS között komplementaritás van, akkor kettős hélixet alkotnak egymás között, amelynek jelenlétét a próba jelölésének típusától függően módszerekkel mutatják ki: radioaktivitás számlálás, enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA) vagy denzitometria. .
Mikroba jelenlétének meghatározása a vizsgált anyagban mikrochippel
A mikrochip egy üveglemez, amelyhez 100-1000 molekuláris DNS-próba kapcsolódik, amelyek egy adott taxonómiai egységre specifikus, bizonyos területeken lokalizált nukleotidszekvenciát képviselnek (5.6. ábra).
Rizs. 5.6. Egy adott DNS-szekvencia mikrochippel történő kimutatásának elve
A tesztmintából teljes DNS-t izolálunk, amely a 16S RNS gén stabil szekvenciájából amplifikálható. Az izolált DNS-t fluorokrómmal vagy enzimmel jelölik, és ezzel kezelik a mikrochipet, megteremtve a hibridizáció feltételeit. A meg nem kötött DNS-t lemossuk, és a molekuláris hibridek lokalizációját ELISA-val vagy denzitometriával határozzuk meg.
A polimeráz láncreakció lehetővé teszi a mikroba kimutatását a vizsgált anyagban (víz, termékek, páciensből származó anyag) a benne lévő mikrobiális DNS jelenlétével anélkül, hogy az utóbbit tiszta tenyészetbe izolálná.
Ennek a reakciónak a végrehajtásához a vizsgált anyagból DNS-t izolálnak, amelyben meghatározzák az adott mikrobára specifikus gén jelenlétét. A gént a felhalmozódása alapján lehet kimutatni. Ehhez az eredeti gén DNS-ének 3"-végével komplementer primerek (magok) szükségesek. A gén felhalmozódása (amplifikációja) az alábbiak szerint történik. A vizsgálati anyagból izolált DNS-t felmelegítjük. Ilyenkor a DNS 2 szálra bomlik.Primereket adunk hozzá.A DNS és a primerek keverékét lehűtjük.Ebben az esetben a primerek,ha a kívánt gén jelen van a DNS-keverékben, annak komplementer régióihoz kötődnek. DNS-polimerázt és nukleotidokat adunk a DNS és a primer keverékéhez. Beállítjuk a DNS-polimeráz működéséhez optimális hőmérsékletet. Ilyen körülmények között, ha a gén és a primer DNS-e komplementer, nukleotidok hozzáadása a 3"-hoz. primerek végeit, ami a gén két kópiájának szintézisét eredményezi. Ezt követően a ciklus újra megismétlődik, a gén DNS mennyisége minden alkalommal megduplázódik (5.7. ábra). A reakciót speciális eszközökben - erősítőkben - hajtják végre. Az eredményt az amplifikált DNS utólagos denzitometriájával vagy poliakrilamid gélben végzett elektroforézisével értékeljük. A PCR-t vírusos és bakteriális fertőzések diagnosztizálására használják.
Valós idejű PCR A "gyorsított PCR-módszert jelenti, amelyben az amplifikációt és az amplifikációs termék meghatározását egyidejűleg hajtják végre. Erre a célra egy molekuláris szondát vezetnek be az amplifikációs csőbe, amely az amplifikált lánchoz kötve egy bizonyos hullámhosszú fluoreszcens jelet generál. A reakció automatikusan lezajlik.
Rizs. 5.7. Polimeráz láncreakció (séma)
Transzkripció által közvetített amplifikáció Az rRNS-t vegyes fertőzések diagnosztizálására használják. Ez a módszer egy adott baktériumfajra specifikus, amplifikált rRNS-ek molekuláris hibridizációval történő kimutatásán alapul. A tanulmány három szakaszban zajlik:
rRNS-készlet amplifikálása a vizsgált anyagból izolált DNS-mátrixon DNS-függő RNS-polimeráz segítségével;
A felhalmozott rRNS-készlet hibridizálása fluorokrómmal vagy enzimekkel jelölt, komplementer fajspecifikus rRNS-oligonukleotidokkal;
Hibridizációs termékek meghatározása denzitometriával és ELISA-val.
A reakció automatikusan lezajlik azokban a létesítményekben, amelyekben a különböző baktériumfajokhoz tartozó rRNS egyidejű meghatározását úgy érik el, hogy az amplifikált rRNS-készletet több mintára osztják, amelyekbe hibridizáció céljából a fajspecifikus rRNS-sel komplementer jelölt oligonukleotidokat adnak.
Biológiai természetű mutagén tényezőknek tekinthetők Mobil (= vándorló ) a baktériumok genetikai elemei – diszkrét DNS-szegmensek, amelyek képesek önállóan mozogni az egyik régióból a másikba a replikonon belül, valamint az egyik replikonból (kromoszómális, plazmid vagy fág) a másikba. Ezek az elemek a következők: egyszerű inszerciós szekvenciák (IS elemek), transzpozonok (Tn elemek) és fág transzpozonok (Mu, D3112 stb.). Replikonokba való integrálódásuk az általános sejtrekombináció rendszerétől függetlenül történik, ami a rekombinációs struktúrákban kötelező homológiát igényel.
IS elemek A kettős szálú DNS lineáris fragmentumai, amelyek hossza 200-2000 bp. Csak géneket tartalmaznak tnp, amelyek a migrációjukhoz (transzpozícióhoz) szükséges transzpozáz enzim szintézisét kódolják. Az IS elemek végén invertált terminális ismétlődések (ITR) találhatók. A különböző IS elemeknél a terminális ITR ismétlődések hossza 8 és 40 bp között változik. A fordított ismétlések is szerepet játszanak, és fontosak az átültetés szempontjából. Az IS elem szerkezete sematikusan a következőképpen ábrázolható:
Az IS-elemeknek többféle típusa létezik: IS1, IS2, IS3, IS4 stb. A terminálismétlések hosszában és szerkezetében különböznek egymástól.
Az IS elemek a bakteriális kromoszómák és plazmidok normális alkotóelemei. A különböző replikonok különböző, gyakran többszörös számú másolatot tartalmazhatnak az IS-elemekből. Az IS elemek a genom egyik régiójából a másikba mozoghatnak, például egy bakteriális kromoszómából egy plazmidba vagy plazmidból plazmidba. Egyetlen génbe is beépülhetnek, és inaktiválhatják vagy megváltoztathatják a szabályozását.
Transzpozonok – összetett vándorló elemek. Jelölve: Tn 1, Tn 2,... Tn100, Tn 1002 stb. Az IS elemektől abban különböznek, hogy a transzpozícióért felelős gének mellett olyan szerkezeti géneket is tartalmaznak, amelyek bármely fenotípus megnyilvánulásáért felelősek. A transzpozonok szabályozhatják az antibiotikumokkal és nehézfém-ionokkal szembeni rezisztenciát, a laktóz-, raffinóz-katabolizáló képességet, a toluol lebontását, az enterotoxin szintézist stb., így könnyebben kimutathatók, mint az IS elemek. A transzpozonok hossza meghaladja a 2000 bp-t. Az IS elemekhez hasonlóan a transzpozonok fordított terminális ismétlésekkel (ITR) rendelkeznek, amelyek gyakran IS elemek. A transzpozonokat nem csak szerkezetük és összetételük különbözteti meg, hanem a replikonokba való integráció helyeinek megválasztásának specifitása is. Meg kell azonban jegyezni, hogy ugyanazon transzpozon transzpozíciójának specifitása különböző baktériumfajokra és replikonokra eltérő lehet.
A transzpozonok és IS elemek migrációjának gyakorisága 10 –4 –10 –7 valószínűséggel fordul elő bakteriális sejtosztódásonként. Ez függhet a donor és a recipiens replikonok természetétől, valamint a gazdasejt genomjától. Emellett a transzpozonok mozgását környezeti tényezők (hőmérséklet, UV-sugarak, kémiai vegyületek stb.) is befolyásolhatják. A transzpozon mozgásának mechanizmusai nem teljesen ismertek.
Bakteriofág Mu a mérsékelt bakteriofágokhoz tartozik. Jellegzetessége a mutagenitás, ami a névben is tükröződik Mu (mu tator). Ezt a bakteriofágot először baktériumokban fedezték fel E. coli, de a sejteken is szaporodik Shigella, Klebsiella, Pseudomonas, Citrobacter, Salmonella stb. Mobil genetikai elemnek minősül, mivel sok tekintetben hasonlít az IS elemekhez és transzpozonokhoz, és lényegében csak abban különbözik, hogy vírusrészecskéket képezhet. Az IS elemekkel és transzpozonokkal való hasonlóság elsősorban abban nyilvánul meg, hogy a Mu-fág (lineáris kétszálú DNS - 38 kb) genomjának végén is vannak fordított ismétlődések, de csak két nukleotidpárból.