Son elementos de bacterias. Estructura del genoma bacteriano.
genoma bacteriano consta de elementos genéticos capaces de replicarse independientemente, es decir replicones. Los replicones son cromosoma bacteriano Y plásmidos.
La información hereditaria se almacena en las bacterias en forma de una secuencia de nucleótidos de ADN, que determinan la secuencia de aminoácidos en una proteína. Cada proteína tiene su propio gen, es decir, una región discreta del ADN que difiere en el número y la especificidad de la secuencia de nucleótidos.
cromosoma bacteriano representado por una molécula de ADN bicatenario en forma circular. Dimensiones del cromosoma bacteriano en varios representantes del reino. procariotas variar. El cromosoma bacteriano forma el nucleoide compacto de la célula bacteriana. El cromosoma bacteriano tiene un conjunto de genes haploides. Codifica funciones vitales para la célula bacteriana.
Plásmidos Las bacterias son moléculas de ADN de doble cadena. Codifican funciones que no son esenciales para la vida de una célula bacteriana, pero que le dan ventajas cuando se exponen a condiciones de vida desfavorables.
Las propiedades de los microorganismos, como cualquier otro organismo, están determinadas por su genotipo, es decir. la totalidad de los genes de un individuo determinado. El término "genoma" en relación con los microorganismos es casi sinónimo del concepto "genotipo".
fenotipo es el resultado de la interacción entre el genotipo y el medio ambiente, es decir, la manifestación del genotipo en condiciones de vida específicas. El fenotipo de los microorganismos, aunque depende del medio ambiente, está controlado por el genotipo, ya que la naturaleza y el grado de los cambios estenotípicos posibles para una célula determinada están determinados por un conjunto de genes, cada uno de los cuales está representado por una determinada sección del ADN. molécula.
En el corazón de la variabilidad radica en un cambio en la respuesta del genotipo a factores ambientales o en un cambio en el genotipo mismo como resultado de una mutación o recombinación genética. En este sentido, la variabilidad fenotípica se divide en hereditaria y no hereditaria.
La variabilidad no hereditaria (ambiental, modificación) es causada por la influencia de factores intra y extracelulares en la manifestación del genotipo. Cuando se elimina el factor que provocó la modificación, estos cambios desaparecen.
La variabilidad hereditaria (genotípica) asociada con mutaciones es variabilidad mutacional. La base de la mutación son los cambios en la secuencia de nucleótidos en el ADN, su pérdida total o parcial, es decir, se produce una reordenación estructural de los genes, que se manifiesta fenotípicamente en forma de un rasgo alterado.
La variación hereditaria asociada con la recombinación se llama variación de recombinación.
Elementos genéticos móviles.
La composición del genoma bacteriano, tanto el cromosoma bacteriano como los plásmidos, incluye Elementos genéticos móviles. Los elementos genéticos móviles incluyen secuencias de inserción y transposones.
Insertar (inserción) secuencias Los elementos IS son secciones de ADN que son capaces de moverse en su conjunto de una sección de un replicón a otra, así como entre replicones. Contienen sólo aquellos genes que son necesarios para su propio movimiento - transposición: el gen que codifica la enzima transposasa, asegurar el proceso de exclusión del elemento IS del ADN y su integración en un nuevo locus, y un gen que determina la síntesis de un represor que regula todo el proceso de movimiento.
Una característica distintiva de los elementos IS es la presencia de una secuencia de inserción en los extremos. repeticiones invertidas. Estas repeticiones invertidas son reconocidas por la enzima. transposasa. La transposasa lleva a cabo roturas monocatenarias en las cadenas de ADN ubicadas a ambos lados del elemento transponible. La copia original del elemento IS permanece en el mismo lugar y su duplicado replicado se traslada a un nuevo sitio.
El movimiento de elementos genéticos móviles suele denominarse recombinación replicativa o ilegítima. Sin embargo, a diferencia del cromosoma bacteriano y los plásmidos, los elementos genéticos móviles no son replicones independientes, ya que su replicación es un elemento integral de la replicación del ADN del replicón en el que se ubican.
Se conocen varias variedades de elementos IS, que difieren en tamaño y en los tipos y número de repeticiones invertidas.
Transposones- Se trata de segmentos de ADN que tienen las mismas propiedades que los elementos IS, pero que tienen genes estructurales, es decir, genes que garantizan la síntesis de moléculas que tienen una propiedad biológica específica, como la toxicidad, o proporcionan resistencia a los antibióticos.
Al moverse a lo largo de un replicón o entre replicones, los elementos genéticos móviles provocan:
1. Inactivación de los genes de aquellas secciones del ADN donde, habiéndose movido, están integradas.
2. Formación de daños al material genético.
3. Fusión del replicón, es decir, inserción del plásmido en el cromosoma.
4. Distribución de genes en una población bacteriana, que puede provocar cambios en las propiedades biológicas de la población, un cambio en los patógenos de enfermedades infecciosas y también contribuye a los procesos evolutivos entre los microbios.
Los cambios en el genoma bacteriano y, en consecuencia, en las propiedades de las bacterias, pueden ocurrir como resultado de mutaciones y recombinaciones.
Se han descubierto organismos superiores, oncogenes, etc. (ver Elementos genéticos migratorios).
ES ELEMENTOS Y TRANSPOSONES EN BACTERIAS
Los transposones, junto con los plásmidos y los fagos (en los que se integran fácilmente), son capaces de intercambiar varios genes contenidos en ellos entre especies de bacterias muy distantes, por lo que desempeñan un papel extremadamente importante en la evolución de las bacterias, incluida su adaptación a lek. . en usted y su producción de nuevas toxinas.
Los transposones y los 15 elementos son responsables de una variedad de fenómenos genéticos en las bacterias. La inserción de un elemento transponible en un gen puede provocar su inactivación. Además, algunos elementos IS y transposones causan inestabilidad genética cerca del lugar de su localización en las proximidades del elemento, la frecuencia de deleciones e inversiones aumenta notablemente y uno de los límites del reordenamiento siempre coincide con uno de los extremos del De 15 elementos, autónomo o como parte de un transposón. Los elementos móviles también pueden provocar translocaciones. De hecho, dos elementos IS ubicados a cierta distancia uno del otro pueden considerarse como un transposón, y tales transposones son realmente capaces de moverse como una sola unidad, aunque al menos para algunos elementos IS se ha demostrado que la frecuencia de movimiento de tales una estructura compuesta disminuye rápidamente al aumentar la distancia entre los elementos IS flanqueantes.
Paradojas similares. Puede resolverse recordando que tanto los plásmidos como los elementos genéticos móviles tienen una autonomía comparativa de la mayor parte del material genético y, por lo tanto, pueden considerarse como una especie de organismos que viven en un entorno genético especial. Así, las funciones de los plásmidos, elementos IS y transposones no se pueden considerar desde el punto de vista de las ventajas que aportan a las bacterias huésped, sino desde el punto de vista de su automantenimiento en las poblaciones bacterianas, es decir, uno Se pueden considerar elementos autónomos de procariotas de ADN egoísta, proporcionando el primer turno de reproducción propia. En este sentido. Los elementos móviles y los plásmidos están directamente adyacentes a los virus, cuyas tendencias egoístas son obvias.
¿Qué genes resultan útiles y se incluyen en los elementos móviles? Esta no es una pregunta ociosa, ya que cada célula bacteriana está bien adaptada a su entorno y no necesita genes similares a los que ya tiene y que aseguren su adaptación al ambiente. Por otra parte, la adaptación a un entorno completamente nuevo parece requerir una reordenación relativamente significativa del material genético de la célula, incluida, en particular, la coadaptación de muchos genes diferentes. Por lo tanto, una célula puede obtener una ventaja selectiva mediante la adquisición de un gen (como parte de un transposón) sólo si este gen en sí es capaz de ser beneficioso para la bacteria en determinadas condiciones, es decir, son precisamente estos genes los que son beneficiosos para los transposones. tener en su composición. De hecho, los genes de resistencia a diversos venenos bacterianos, incluidos los metales pesados y los antibióticos, viajan en transposones, los genes de vías metabólicas adicionales, lo que permite el uso, por ejemplo, de alguna inusual y, finalmente, los genes de algunas toxinas, que hacen que las bacterias sean patógenas y permitiéndoles así cambiar significativamente su estilo de vida.
| Arroz. 15.13. Identificación de transposones mediante examen microscópico electrónico de heterodúplex. Para hacer visible el transposón, se calienta el ADN de la bacteria natural (B) y de la bacteria que porta el transposón (A), lo que provoca que las cadenas de doble hélice se separen (se fundan). Con el posterior enfriamiento lento de la mezcla, se produce el emparejamiento de bases complementarias de las cadenas de ADN individuales A y B, lo que conduce a la formación de heterodúplex de ADN. Si en los extremos del transposón hay elementos IS complementarios orientados de manera opuesta, entonces estas regiones también se emparejan y forman un tallo, en el que sobresale lateralmente la parte media del transposón en forma de bucle de una sola hebra. |
Los transposones bacterianos tienen una organización estructural similar (fig. 2.1). Todos ellos están limitados por repeticiones invertidas terminales, cuya longitud y composición varían entre los diferentes transposones (de diez a varios cientos de pb). Sin embargo, para un determinado transposón son constantes únicas, es decir, no cambian cuando se introduce en diferentes sitios. Un rasgo característico de los transposones bacterianos es el hecho de que están unidos en ambos extremos por repeticiones directas del ADN receptor (ADN objetivo). La longitud de estas repeticiones varía de 5 a 9 pb, pero para un elemento particular es constante. La secuencia de nucleótidos en repeticiones está determinada por la ubicación del elemento. En sitios de origen independiente, el transposón está flanqueado por repeticiones de diferente composición.
Mutaciones causadas por transposones. En la genética de las bacterias, el método de obtención de mutaciones mediante transposones está adquiriendo cada vez más importancia. Los transposones (Tn) son cadenas dobles cortas de ADN que constan de más de 2.000 pares de bases y que normalmente provocan resistencia a un antibiótico, en casos excepcionales a varios. Los transposones son capaces de saltar de una región del genoma a otra, en particular de una De esta manera, del cromosoma bacteriano al plásmido y viceversa, se pueden incluir en varias partes del genoma (ver sección 15.3.1). Si se introduce un transposón en cualquier gen estructural del cromosoma, la secuencia de nucleótidos de este gen se alterará. y la información genética no podrá traducirse en un polipéptido completo funcional. Surgirá un mutante de inserción.
Ya se mencionó anteriormente que los elementos móviles provocan inestabilidad genética en las proximidades de su lugar de localización. Esta característica se explica fácilmente por las propiedades ya conocidas de los elementos IS y los transposones de las bacterias. 80 muestra lo que sucede cuando un transposón del tipo Tn3 se mueve dentro de un replicón, es decir con un mecanismo de transposición replicativo. Dependiendo de cómo se introduzcan las roturas en el ADN objetivo, se producirá una eliminación o una inversión del material genético entre la ubicación del transposón y el objetivo de su movimiento. De hecho, la formación de una deleción se asemeja al proceso de desintegración cointegrada, pero como una de las moléculas de ADN resultantes no tiene un origen de replicación, se pierde. Si se produce una inversión, entonces en ambos límites hay una copia del transposón en una orientación invertida entre sí. Por tanto, la formación de deleciones e inversiones es característica del mecanismo replicativo de las transposiciones.
Una propiedad clave de los elementos transponibles bacterianos que garantiza su conservación es su capacidad para pasar de un replicón a otro. La presencia de plásmidos transmisibles y movilizables en las bacterias permite que los transposones y los elementos IS no sólo se muevan de un plásmido a otro o de un cromosoma a otro, sino también de una célula a otra como parte de los plásmidos. De esta manera, los elementos móviles pueden propagarse por las poblaciones bacterianas incluso si no aportan ningún beneficio a sus huéspedes. En este sentido, vale la pena mencionar el fenómeno de la inmunidad a la transposición; es mucho más probable que muchos transposones y elementos IS se muevan a nuevos replicones que a un nuevo lugar en el replicón en el que se encuentran. El mecanismo molecular de esta propiedad aún no se ha dilucidado, pero es obvio que promueve la distribución del elemento transponible sobre el número máximo de replicones.
Los elementos IS idénticos y los transposones ubicados en diferentes replicones son capaces de facilitar la recombinación homóloga, lo que lleva a la formación de un cointegrado. De esta forma, algunos plásmidos se integran de forma reversible en el cromosoma bacteriano, lo que asegura inmediatamente la adición de un fragmento significativo de material genético (Fig. 82). Los plásmidos que pueden insertarse en el cromosoma bacteriano y extraerse de allí se denominan episomas. A veces, la escisión del episoma puede ocurrir en un par de elementos IS diferente a aquel a través del cual tuvo lugar la integración. En este caso, el plásmido puede capturar parte del material cromosómico y parte de su ADN.
Se introdujo un plásmido que llevaba un transposón Tn5 modificado con un gen de toxina integrado en una bacteria en la que se insertó el transposón Tn5 de tipo salvaje en su ADN cromosómico.
En muchas bacterias se han encontrado elementos plasmídicos genéticos no cromosómicos, fagos templados y elementos migratorios (transposones y 15 elementos). Los plásmidos se caracterizan por una existencia estable en un estado no cromosómico. Los transposones y los 15 elementos son, por regla general, parte de los cromosomas, pero son capaces de transferirse de un cromosoma a un plásmido y, por lo tanto, también pueden clasificarse como elementos genéticos no cromosómicos.
Los transposones pueden servir como marcador de un gen destinado a la clonación. Como se sabe, en la clonación de genes cromosómicos de bacterias a veces surgen dificultades debido a que no existe un método sencillo para determinar cuál de los plásmidos que llevan un fragmento integrado de ADN cromosómico contiene el gen que interesa al investigador. A veces, este problema se puede resolver aislando primero un mutante de este gen con un transposón incluido o ubicado cerca.
El ADN cromosómico de las células procarióticas y eucariotas también contiene genes móviles de control o llamados "saltadores": los transposones (Tn), descubiertos por primera vez en el maíz por B McClintock en 1940. Están ubicados a una distancia considerable de otros genes que están influenciados por En las mutaciones, llamadas "explosiones de transposones", es posible un movimiento masivo y, hasta cierto punto, dirigido de elementos genéticos. Los transposones son capaces de replicarse e insertarse (insertar) en forma de una de las copias en una nueva ubicación del genoma. (ADN central) En las bacterias, la parte predominante de los transposones codifica una enzima.
5.1. Estructura del genoma bacteriano.
La información hereditaria se almacena en las bacterias en forma de una secuencia de nucleótidos de ADN, que determinan la secuencia de aminoácidos en una proteína (la estructura del ADN se describe en la sección 3.1 y se muestra en la Fig. 3.1).
Cada proteína tiene su propio gen, es decir. una región discreta del ADN que difiere en el número y especificidad de la secuencia de nucleótidos.
El conjunto de todos los genes de las bacterias se llama genoma. El tamaño del genoma está determinado por el número de pares de bases de nucleótidos (pb). El genoma bacteriano tiene un conjunto de genes haploides. El genoma bacteriano consta de elementos genéticos capaces de replicarse (reproducirse) de forma independiente, es decir. replicones. Los replicones son el cromosoma bacteriano y los plásmidos.
5.1.1. cromosoma bacteriano
El cromosoma bacteriano está representado por una molécula de ADN de doble cadena. Dimensiones del cromosoma bacteriano en varios representantes del dominio. procariotas variar. Por ejemplo, en E. coli el cromosoma bacteriano contiene 4,7x10 6 pb. Contiene alrededor de 4300 genes. A modo de comparación: el tamaño del ADN viral es de aproximadamente 10 3 pb, el de la levadura, 10 7 pb y la longitud total del ADN cromosómico humano es de 3x10 9 pb.
cromosoma bacteriano E. coli representado por 1 molécula de ADN circular. Varias otras bacterias también tienen un cromosoma en anillo: Shigella spp, Salmonella spp, P. aeruginosa, B. subtilus. Sin embargo, esta estructura del genoma no es universal. En algunas bacterias, en particular en V. cholerae, L. interrhogans, Brucella spp., tener
Hay dos cromosomas en anillo. En muchas otras bacterias (B. burgdorferi, Streptomyces spp.) Se descubrieron los cromosomas lineales.
El cromosoma bacteriano forma el nucleoide compacto de la célula bacteriana. Codifica funciones vitales para la célula bacteriana.
5.1.2. Plásmidos bacterianos
Los plásmidos son moléculas de ADN de doble hebra cuyo tamaño varía entre 10 3 y 10 6 pb. Pueden tener forma de anillo o lineales. Los plásmidos codifican funciones que no son esenciales para la vida de una célula bacteriana, pero que le dan ventajas cuando se exponen a condiciones de vida desfavorables.
Entre las características fenotípicas impartidas a la célula bacteriana por los plásmidos se encuentran las siguientes:
Resistencia antibiótica;
Producción de factores de patogenicidad;
Capacidad para sintetizar sustancias antibióticas;
Formación de colicinas;
Descomposición de sustancias orgánicas complejas;
Formación de enzimas de restricción y modificación. La replicación del plásmido ocurre independientemente del cromosoma c.
la participación del mismo conjunto de enzimas que lleva a cabo la replicación del cromosoma bacteriano (ver sección 3.1.7 y Fig. 3.5).
Algunos plásmidos están bajo control estricto. Esto significa que su replicación está acoplada a la replicación del cromosoma, de modo que cada célula bacteriana contiene una o al menos varias copias de plásmidos.
El número de copias de plásmidos bajo control débil puede alcanzar de 10 a 200 por célula bacteriana.
Para caracterizar los replicones de plásmidos, normalmente se dividen en grupos de compatibilidad. La incompatibilidad de plásmidos se asocia con la incapacidad de dos plásmidos de persistir de manera estable en la misma célula bacteriana. La incompatibilidad es característica de aquellos plásmidos que tienen una alta similitud de replicones, cuyo mantenimiento en la célula está regulado por el mismo mecanismo.
Los plásmidos que pueden incorporarse de forma reversible al cromosoma bacteriano y funcionar como un único replicón se denominan integrativo o episomas.
Los plásmidos que pueden transferirse de una célula a otra, a veces incluso pertenecientes a una unidad taxonómica diferente, se denominan transmisible (conjugativo) La transmisibilidad es inherente sólo a los plásmidos grandes que tienen un traoperón, que combina los genes responsables de la transferencia de plásmidos. Estos genes codifican los pili sexuales, que forman un puente con una célula que no contiene un plásmido transmisible, a través del cual el ADN del plásmido se transfiere a una nueva célula. Este proceso se llama conjugación(se discutirá en detalle en la sección 5.4.1). Las bacterias que transportan plásmidos transmisibles son sensibles a los bacteriófagos filamentosos "masculinos".
Los plásmidos pequeños que no portan genes tra no pueden transmitirse por sí mismos, pero son capaces de transmitirse en presencia de plásmidos transmisibles utilizando su aparato de conjugación. Estos plásmidos se denominan movilizado, y el proceso en sí - movilización plásmido no transmisible.
De particular importancia en microbiología médica son los plásmidos que proporcionan resistencia bacteriana a los antibióticos, que se denominan plásmidos R (del inglés. resistencia - contrarrestación), y plásmidos que aseguran la producción de factores de patogenicidad que contribuyen al desarrollo del proceso infeccioso en el macroorganismo. Los plásmidos R contienen genes que determinan la síntesis de enzimas que destruyen los fármacos antibacterianos (por ejemplo, antibióticos). Como resultado de la presencia de dicho plásmido, la célula bacteriana se vuelve resistente (resistente) a la acción de todo un grupo de fármacos y, a veces, a varios fármacos. Muchos plásmidos R son transmisibles y se propagan por toda la población bacteriana, haciéndola inaccesible a los efectos de los fármacos antibacterianos. Las cepas bacterianas portadoras de plásmidos R suelen ser los agentes etiológicos de las infecciones nosocomiales.
Actualmente se han encontrado plásmidos que determinan la síntesis de factores de patogenicidad en muchas bacterias que son agentes causantes de enfermedades infecciosas humanas. La patogenicidad de los patógenos de shigelosis, yersiniosis, peste, ántrax, boreliosis ixódida y escherichiosis intestinal está asociada con la presencia y funcionamiento de plásmidos de patogenicidad.
Algunas células bacterianas contienen plásmidos que determinan la síntesis de agentes bactericidas contra otras bacterias.
pozos de sustancias. Por ejemplo, algunos E. coli Poseen el plásmido Col, que determina la síntesis de colicinas, que tienen actividad microbicida contra bacterias coliformes. Las células bacterianas que transportan dichos plásmidos tienen ventajas a la hora de colonizar nichos ecológicos.
Los plásmidos se utilizan en la práctica humana, en particular en la ingeniería genética, para la construcción de cepas bacterianas recombinantes especiales que producen grandes cantidades de sustancias biológicamente activas (ver Capítulo 6).
5.1.3. Elementos genéticos móviles.
Los elementos genéticos móviles se encuentran en el genoma bacteriano tanto en el cromosoma bacteriano como en los plásmidos. Los elementos genéticos móviles incluyen secuencias de inserción y transposones.
Insertar (inserción) secuencias - Elementos IS (del inglés. secuencias de inserción)- Se trata de secciones de ADN que son capaces de moverse en su conjunto de una sección de un replicón a otra, así como entre replicones. Los elementos IS tienen un tamaño de 1000 pb. y contienen solo aquellos genes que son necesarios para su propio movimiento - transposición: un gen que codifica la enzima transposasa, que asegura el proceso de exclusión del elemento IS del ADN y su integración en un nuevo locus, y un gen que determina la síntesis de un represor que regula todo el proceso de movimiento. Estos genes están flanqueados por repeticiones invertidas que sirven como sitios de recombinación que acompañan el movimiento de la secuencia de inserción con la participación de enzimas de transposición, en particular transposasas.
Las repeticiones invertidas son reconocidas por la enzima transposasa (fig. 5.1), que realiza roturas monocatenarias en las cadenas de ADN ubicadas a ambos lados del elemento transponible. La copia original del elemento IS permanece en el mismo lugar y su duplicado replicado se mueve al nuevo sitio.
El movimiento de elementos genéticos móviles suele denominarse recombinación replicativa o ilegítima. Sin embargo, a diferencia del cromosoma y los plásmidos bacterianos, los elementos genéticos móviles no son replicones independientes,
Arroz. 5.1. Esquema de la estructura del elemento IS: 1 - gen represor; 2 - gen de la transposasa; Las flechas indican lugares de ruptura.
ya que su replicación es un elemento integral de la replicación del ADN del replicón en el que se ubican.
Los elementos IS varían en tamaño, tipo y número de repeticiones invertidas.
Transposones - Se trata de segmentos de ADN que tienen las mismas propiedades que los elementos IS, pero contienen genes estructurales, es decir. genes que proporcionan la síntesis de moléculas que tienen una propiedad biológica específica, como toxicidad, o proporcionan resistencia a los antibióticos.
El movimiento de elementos genéticos móviles a lo largo de un replicón o entre replicones provoca:
Inactivación de genes de aquellas secciones del ADN donde, habiéndose movido, están integrados;
Formación de daño al material genético;
Fusión de replicones, es decir integración del plásmido en el cromosoma;
La propagación de genes en una población bacteriana, que puede provocar cambios en las propiedades biológicas de la población, un cambio en los patógenos de enfermedades infecciosas y también contribuye a los procesos evolutivos entre los microbios.
5.1.4. integrones
Además de los plásmidos y los elementos genéticos móviles, las bacterias tienen otro sistema que favorece la propagación de genes: el sistema de integrones. integrones son un sistema para capturar pequeños elementos del ADN llamados casetes de genes, a través de recombinación específica de sitio y su expresión.
El integrón consta de una región conservada ubicada en el extremo 5", que contiene el gen que codifica la enzima integrasa, un sitio de recombinación. att y el promotor P (fig. 5.2).
El casete puede existir en dos formas: lineal, cuando el casete está integrado en un integrón, y en forma de un pequeño ADN circular de doble cadena. Los casetes tienen tamaños de 260 a 1500 pb. Contienen predominantemente 1 gen de resistencia a los antibióticos y un sitio de recombinación que consta de 59 pares de bases ubicados en el extremo 3".
La integrasa lleva a cabo la recombinación entre el sitio de 59 pb. casetes y trama att integrón, incorporando los genes del casete en el integrón en una orientación tal que puedan expresarse a partir del promotor del integrón P. La integración de casetes en un integrón es un proceso reversible. Los integrones pueden ubicarse tanto en el cromosoma como en los plásmidos. Por lo tanto, es posible que los casetes se muevan de un integrón a otro, tanto dentro de una célula bacteriana como en toda la población bacteriana. Un solo integrón puede capturar múltiples casetes de resistencia a antibióticos. Cambios
Arroz. 5.2. Estructura integrónica: attu- sitio de recombinación de integrones; intI- gen que codifica la integrasa; P - promotor; atc- sitios de recombinación de casetes de resistencia a antibióticos
El genoma bacteriano, y por tanto las propiedades de las bacterias, pueden surgir como resultado de mutaciones y recombinaciones.
5.1.5. Islas de patogenicidad
En el genoma de las bacterias patógenas (ver Capítulo 8) hay secciones de ADN de al menos 10.000 pares de nucleótidos de longitud que se diferencian del genoma principal en la composición de los pares de bases de nucleótidos G-C. Estas áreas son responsables de la síntesis de factores de patogenicidad que aseguran el desarrollo del proceso patológico en el organismo huésped, por lo que se denominaron islas de patogenicidad. Las islas de patogenicidad suelen estar flanqueadas por repeticiones directas de secuencias de ADN o elementos IS. Algunos contienen regiones características de sitios de integración ubicados cerca de genes de ARNt. La mayoría de las islas de patogenicidad se localizan en el cromosoma bacteriano. (Salmonela), pero también pueden ser parte de plásmidos (Shigella) y ADN de fagos (V cholerae O1, O139).
5.2. Mutaciones en bacterias
Las mutaciones son cambios en la secuencia de nucleótidos individuales del ADN, que fenotípicamente conducen a manifestaciones tales como cambios en la morfología de la célula bacteriana, la aparición de necesidades de factores de crecimiento, por ejemplo, aminoácidos, vitaminas, es decir, auxotrofia, resistencia a los antibióticos, cambios en la sensibilidad a la temperatura, disminución de la virulencia (atenuación), etc.
Una mutación que resulta en pérdida de función se llama mutación directa. Los mutantes pueden experimentar la restauración de sus propiedades originales, es decir. reversión (del inglés. contrarrestar - atrás). Si se restaura el genotipo original, entonces la mutación que restaura el genotipo y el fenotipo se llama inversa o directa. reversión. Si una mutación restaura el fenotipo sin restaurar el genotipo, entonces dicha mutación se llama supresor. Las mutaciones supresoras pueden ocurrir tanto dentro del mismo gen en el que ocurrió la mutación primaria como en otros genes, o pueden estar asociadas con mutaciones en el ARNt.
Según la magnitud de los cambios en el daño del ADN, se distinguen las mutaciones puntuales, cuando el daño se limita a uno
un par de nucleótidos, y extendidos o aberraciones. En este último caso se puede observar pérdida de varios pares de nucleótidos, que se denominan supresión, adición de pares de nucleótidos, es decir duplicaciones movimiento de fragmentos de cromosomas, translocaciones y reordenamientos de pares de nucleótidos - inversiones.
Las mutaciones pueden ser espontáneo, es decir surgiendo espontáneamente, sin influencia externa, y inducido.
Punto espontáneo Las mutaciones ocurren como resultado de errores durante la replicación del ADN, que está asociado con el movimiento tautomérico de electrones en bases nitrogenadas.
La timina (T), por ejemplo, suele encontrarse en forma ceto, en la que es capaz de formar enlaces de hidrógeno con la adenina (A). Pero si la timina se convierte en forma de enol durante el emparejamiento de bases durante la replicación del ADN, se empareja con la guanina. Como resultado, en la nueva molécula de ADN, aparece un par G-C en el lugar donde anteriormente estaba el par A-T.
Las aberraciones cromosómicas espontáneas surgen debido al movimiento de elementos genéticos móviles. Las mutaciones inducidas aparecen bajo la influencia de factores externos, que se denominan mutágenos. Los mutágenos son físicos (rayos ultravioleta, radiación γ), químicos (análogos de bases purínicas y pirimidínicas, ácido nitroso y sus análogos y otros compuestos) y biológicos: transposones.
Los análogos de las bases purina y pirimidina, por ejemplo, 2-aminopurina, 5-bromouracilo, se incluyen en los nucleótidos y, por lo tanto, en el ADN, pero es mucho más probable que se emparejen con parejas "incorrectas" debido a transformaciones tautoméricas, lo que resulta en el reemplazo de una purina con otra purina (A-D) o una pirimidina con otra pirimidina (T-C). Reemplazar una purina por otra purina y una pirimidina por otra pirimidina se llama transición.
El ácido nitroso y sus análogos provocan la desaminación de las bases nitrogenadas, lo que provoca errores durante el emparejamiento y, como consecuencia, la aparición de transición. La adenina, como resultado de la desaminación, se convierte en hipoxantina, que se empareja con la citosina, lo que conduce a la transición AT-GC. La guanina, cuando se desamina, se convierte en xantina, que todavía se empareja con la citosina; por tanto, la desaminación de la guanina no va acompañada de mutación.
Se introducen acridina y proflavina entre bases adyacentes de la cadena de ADN, duplicando la distancia entre ellas. Este cambio espacial durante la replicación puede provocar la pérdida de un nucleótido o la inclusión de un par de nucleótidos adicional, lo que resulta en cambio de marco de lectura ARNt. A partir del lugar donde ocurrió la pérdida o inclusión de un nucleótido, la información se lee incorrectamente.
La irradiación UV afecta predominantemente a las bases pirimidínicas y dos residuos de timina del ADN adyacentes pueden unirse covalentemente.
En bacterias expuestas a la radiación UV, se demostró que el daño causado por la irradiación en el ADN bacteriano puede corregirse parcialmente debido a la presencia de indemnización sistemas Diferentes bacterias tienen varios tipos de sistemas de reparación. Un tipo de reparación ocurre con la luz y está asociado con la actividad de una enzima fotorreactivadora que escinde el dímero de timina. Durante la reparación oscura, se eliminan las secciones defectuosas de la cadena de ADN y la brecha resultante se completa usando ADN polimerasa en la plantilla de la cadena restante y se conecta a la cadena mediante ligasa.
5.3. Recombinación en bacterias.
La recombinación genética es la interacción entre dos ADN de diferentes genotipos, dando como resultado la formación de ADN recombinante que combina los genes de ambos padres.
Las características de la recombinación en las bacterias están determinadas por la ausencia de reproducción sexual y meiosis, durante las cuales se produce la recombinación y un conjunto haploide de genes en organismos superiores. Durante el proceso de recombinación, las bacterias se dividen convencionalmente en células donantes, que transfieren material genético, y células receptoras, que lo reciben. No todo, sino solo una parte del cromosoma de la célula donante penetra en la célula receptora, lo que conduce a la formación de un cigoto incompleto. merocigotos. Como resultado de la recombinación, solo se forma un recombinante en el merocigoto, cuyo genotipo está representado principalmente por el genotipo del receptor, con un fragmento del cromosoma del donante incluido en él. No se forman recombinantes recíprocos.
Según el mecanismo molecular, la recombinación genética en bacterias se divide en homóloga, específica de sitio e ilegítima.
5.3.1. Recombinación homóloga
En la recombinación homóloga, durante el proceso de rotura y reunificación del ADN, se produce un intercambio entre regiones del ADN que tienen un alto grado de homología. El proceso de recombinación homóloga está bajo el control de genes combinados en REC- un sistema formado por genes recA, B, C, D. Los productos de estos genes desenrollan las hebras de ADN y las reorientan para formar el hemiquiasma, la estructura Holiday, y también cortan la estructura Holiday para completar el proceso de recombinación.
5.3.2. Recombinación específica del sitio
Este tipo de recombinación no depende del funcionamiento de los genes. recA, B, C, D, No requiere tramos prolongados de homología de ADN, pero para ello se requieren secuencias de ADN estrictamente definidas y un aparato enzimático especial, específico para cada caso concreto. Un ejemplo de este tipo de recombinación es la integración de un plásmido en un cromosoma bacteriano, que ocurre entre elementos IS idénticos del cromosoma y el plásmido, la integración del ADN del fago lambda en el cromosoma E. coli. La recombinación específica de sitio que ocurre dentro de un replicón también está involucrada en el cambio de actividad genética. Por ejemplo, en Salmonella, la consecuencia de este proceso son variaciones de fase en el antígeno H flagelar.
5.3.3. Recombinación ilegítima o replicativa
La recombinación ilegítima o replicativa no depende de la función genética recA, B, C, D. Un ejemplo de esto es la transposición de elementos genéticos móviles a lo largo de un replicón o entre replicones, mientras que, como ya se señaló en la sección 5.1.3, la transposición de un elemento genético móvil va acompañada de la replicación del ADN.
La recombinación en bacterias es la etapa final de la transferencia de material genético entre bacterias, que se lleva a cabo mediante tres mecanismos: conjugación (cuando las bacterias entran en contacto,
uno de los cuales lleva un plásmido conjugativo), transducción (utilizando un bacteriófago), transformación (utilizando ADN altamente polimerizado).
5.4. Transferencia de información genética en bacterias.5.4.1. Conjugación
La transferencia de material genético de una célula donante a una célula receptora mediante contacto celular directo se denomina conjugación, y fue descubierta por primera vez por J. Lederberg y E. Tatum en 1946.
Una condición necesaria para la conjugación es la presencia de un plásmido transmisible en la célula donante. Los plásmidos transmisibles codifican los pili sexuales, que forman un tubo de conjugación entre la célula donante y la célula receptora, a través del cual el ADN del plásmido se transfiere a la nueva célula. El mecanismo para transferir ADN plasmídico de una célula a otra es que una proteína especial codificada por el operón tra reconoce una secuencia específica en el ADN plasmídico (llamada ADN plasmídico). origen - principio), introduce una rotura de una sola cadena en esta secuencia y se une covalentemente al extremo 5". Luego, la cadena de ADN a la que está unida la proteína se transfiere a la célula receptora y la cadena complementaria intacta permanece en la célula donante. El aparato celular de síntesis de ADN completa las hebras individuales tanto en el donante como en el receptor en una estructura bicatenaria. La proteína asociada con el extremo de 5" de la cadena transferida contribuye al cierre del plásmido en la célula receptora en un anillo. . Este proceso se muestra en la Fig. 5.3, y usando el ejemplo de transferencia del plásmido F a una célula receptora (del inglés. Fertilidad - fertilidad), que es a la vez un plásmido transmisible e integrador. Las células del donante que tienen el factor F se denominan células F + y las células receptoras que no tienen el factor F se denominan células F -. Si el factor F se encuentra en un estado autónomo en la célula del donante, entonces, como resultado del cruce F + * F, la célula receptora adquiere propiedades del donante.
Si se inserta un factor F u otro plásmido transmisible en el cromosoma de una célula donante, entonces el plásmido y el cromosoma comienzan a funcionar como un único replicón transmisible, lo que permite transferir genes bacterianos a células libres de plasma.
Arroz. 5.3. Esquema de conjugación en bacterias: a - transferencia del plásmido F de la célula F + - a la célula F -; b - transferencia de cromosoma bacteriano Hfr* F-
célula receptora media, es decir proceso de conjugación. Las cepas en las que el plásmido está en un estado integrado transfieren sus genes cromosómicos a células libres de plásmido con alta frecuencia y, por lo tanto, se denominan hfr(De inglés alta frecuencia de recombinación - alta frecuencia de recombinación) (Fig. 5.3, b).
El proceso de transferencia de genes cromosómicos en caso de cruce. hfrχ F - siempre comienza con la escisión del ADN en el mismo punto - en el sitio de integración del factor F u otro plásmido transmisible. Una hebra de ADN del donante se transfiere a través de un puente de conjugación a la célula receptora. El proceso va acompañado de la finalización de la hebra complementaria hasta la formación de una estructura bicatenaria. La transferencia de genes cromosómicos durante la conjugación siempre tiene la misma dirección, opuesta al plásmido incorporado. El propio plásmido transmisible se transmite en último lugar. La cadena de ADN del donante, transferida a la célula receptora y completada hasta formar una estructura bicatenaria, se recombina con una región homóloga del ADN del receptor para formar una estructura genética estable. Debido a la fragilidad del puente de conjugación, el factor sexual rara vez se transfiere a la célula receptora, por lo que el recombinante resultante, por regla general, no posee funciones de donante.
Debido a la direccionalidad de la transferencia de genes, la conjugación se utiliza para mapear el genoma bacteriano y construir un mapa genético.
5.4.2. Transducción
La transducción es la transferencia de ADN bacteriano a través de un bacteriófago. Este proceso fue descubierto en 1951 por N. Zinder y J. Lederberg. Durante el proceso de replicación de fagos dentro de las bacterias (ver Sección 3.3), un fragmento de ADN bacteriano ingresa a la partícula del fago y se transfiere a la bacteria receptora durante la infección por fagos. Hay dos tipos de transducción: general La transducción, la transferencia por parte de un bacteriófago de un segmento de cualquier parte del cromosoma bacteriano, se produce debido al hecho de que durante la infección por fagos, el ADN bacteriano se fragmenta y un fragmento de ADN bacteriano del mismo tamaño que el ADN del fago penetra en el fago. cabeza, formando una partícula de fago defectuosa. Este proceso ocurre con una frecuencia de aproximadamente 1 por 1000 partículas de fago (Fig. 5.4, a). Cuando una célula receptora se infecta con una partícula de fago defectuosa, el ADN de la célula donante se "inyecta" en ella y se recombina mediante recombinación homóloga con una región homóloga del cromosoma receptor para formar un recombinante estable. Los fagos P poseen este tipo de transducción. Específico La transducción ocurre cuando el ADN del fago se integra en el cromosoma bacteriano para formar un profago. En el proceso de exclusión del ADNfago del cromosoma bacteriano, como resultado de un proceso aleatorio, se captura un fragmento del cromosoma bacteriano adyacente al sitio de inclusión del ADN del fago, convirtiéndose en un fago defectuoso (Fig. 5.4, b). Dado que la mayoría de los bacteriófagos templados se integran en el cromosoma bacteriano en áreas específicas, dichos bacteriófagos se caracterizan por la transferencia de una determinada sección de ADN bacteriano de la célula donante a la célula receptora. El ADN del fago defectuoso se recombina con el ADN de la célula receptora mediante recombinación específica de sitio. El recombinante se convierte en merodiploide debido al gen introducido. En particular, el bacteriófago transfiere el gen gal a E. coli.
Arroz. 5.4. Esquema de transducción: a - inespecífico (general); b - específico
5.4.3. Transformación
El fenómeno de la transformación fue descrito por primera vez en 1928 por F. Griffiths, quien descubrió la transformación de la cepa R acapsular de neumococos. (Steotococos neumonia) en una cepa que forma una cápsula en forma de S. Griffiths inyectó simultáneamente a los ratones una pequeña cantidad de células R avirulentas y células S muertas por calor. Las células R se obtuvieron de una cepa cuya sustancia capsular pertenecía al tipo S II, y las cepas S muertas por calor pertenecían al tipo S III. Se aislaron neumococos virulentos con cápsula S III de la sangre de ratones muertos.
En 1944, O. Avery, K. McLeod y M. McCarthy establecieron la naturaleza del factor transformante y demostraron que el ADN extraído de neumococos encapsulados puede transformar neumococos no encapsulados en una forma encapsulada. Así, se demostró que el ADN es el portador de información genética.
El proceso de transformación puede ocurrir de forma espontánea en la naturaleza en algunas especies de bacterias, B. subtilis, H. influenzae, S. pneumoniae, cuando el ADN extraído de células muertas es absorbido por las células receptoras. El proceso de transformación depende de la competencia de la célula receptora y del estado del ADN transformador del donante. Competencia - Esto es posible
la capacidad de una célula bacteriana para absorber ADN. Depende de la presencia de proteínas especiales en la membrana celular que tienen una afinidad específica por el ADN. El estado de competencia de las bacterias Gram positivas está asociado a determinadas fases de la curva de crecimiento. El estado de competencia de las bacterias gramnegativas debe crearse artificialmente sometiéndolas a choques térmicos o eléctricos.
Sólo la molécula de ADN bicatenaria y altamente helicoidal tiene actividad transformadora. Esto se debe al hecho de que solo una hebra de ADN penetra en la célula receptora, mientras que la otra, en la membrana celular, se degrada con la liberación de energía, que es necesaria para que la hebra restante penetre en la célula. El alto peso molecular del ADN en transformación aumenta las posibilidades de recombinación, ya que dentro de la célula la cadena de ADN en transformación está expuesta a las endonucleasas. La integración con el cromosoma requiere la presencia de regiones homólogas a él en el ADN transformante. La recombinación ocurre en una cadena, lo que resulta en la formación de una molécula heterodúplex, una cadena de la cual tiene el genotipo receptor y la otra tiene el genotipo recombinante. Los transformantes recombinantes se forman sólo después del ciclo de replicación (Fig. 5.5).
Actualmente, este método es el principal método de ingeniería genética utilizado en la construcción de cepas recombinantes con un genoma determinado.
Arroz. 5.5. Esquema de transformación
5.5. Características de la genética del virus.
La peculiaridad de la estructura del genoma viral es que la información hereditaria se puede registrar tanto en ADN como en ARN, según el tipo de virus.
Las mutaciones en los virus pueden ocurrir espontáneamente durante la replicación del ácido nucleico del virus, así como bajo la influencia de los mismos factores externos y mutágenos que en las bacterias.
Fenotípicamente, las mutaciones del genoma viral se manifiestan por cambios en la estructura antigénica, la incapacidad de causar una infección productiva en una célula sensible, la sensibilidad del ciclo productivo a la temperatura, así como cambios en la forma y tamaño de las placas que forman los virus. se forman en cultivos celulares bajo una capa de agar (ver Capítulo 3.2).
Las propiedades de los virus pueden cambiar cuando varios virus infectan simultáneamente una célula sensible, y los cambios en las propiedades en tales condiciones pueden ocurrir como resultado tanto del intercambio entre materiales de ácido nucleico que pertenecen a diferentes virus (recombinación genética y reactivación genética) como de procesos no acompañado del intercambio de material genético (complementación y mezcla fenotípica).
Recombinación genética Ocurre con mayor frecuencia en virus que contienen ADN. Entre los virus de ARN, se observa en aquellos que tienen un genoma fragmentado, por ejemplo, el virus de la influenza. Durante la recombinación, se produce un intercambio entre regiones homólogas del genoma.
Reactivación genética observado entre los genomas de virus relacionados que tienen mutaciones en diferentes genes. Como resultado de la redistribución del material genético, se forma un genoma hijo completo.
Complementación Ocurre cuando uno de los dos virus que infectan una célula sintetiza una proteína no funcional como resultado de una mutación. Un virus no mutante, que sintetiza una proteína completa, compensa su ausencia en el virus mutante.
Mezcla fenotípica Se observa cuando, cuando una célula sensible se mezcla con dos virus, parte de la descendencia adquiere características fenotípicas inherentes a los dos virus, manteniendo el mismo genotipo.
5.6. Aplicación de métodos genéticos en el diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Los métodos genéticos se utilizan con fines prácticos tanto para detectar un microbio en el material en estudio sin aislar un cultivo puro, como para determinar la posición taxonómica del microbio y realizar una identificación intraespecífica.
5.6.1. Métodos utilizados para la identificación intraespecífica de bacterias.
El análisis de restricción se basa en el uso de enzimas llamadas enzima restrictiva Las enzimas de restricción son endonucleasas que escinden moléculas de ADN rompiendo enlaces de fosfato no en lugares aleatorios, sino en secuencias de nucleótidos específicas. De particular importancia para los métodos de genética molecular son las enzimas de restricción, que reconocen secuencias que tienen simetría central y se leen igualmente en ambas direcciones desde el eje de simetría. El punto de ruptura del ADN puede coincidir con el eje de simetría o desplazarse con respecto a él.
Actualmente, se han aislado y purificado más de 175 enzimas de restricción diferentes a partir de diversas bacterias, para las cuales se conocen sitios (sitios) de reconocimiento (restricción). Se han identificado más de 80 tipos diferentes de sitios en los que pueden producirse roturas de la doble hélice del ADN. El genoma de una unidad taxonómica específica contiene un número estrictamente definido (determinado genéticamente) de sitios de reconocimiento para una enzima de restricción específica. Si el ADN aislado de un microbio en particular se trata con una determinada enzima de restricción, esto conducirá a la formación de un número estrictamente definido de fragmentos de ADN de un tamaño fijo. El tamaño de cada tipo de fragmento se puede determinar mediante electroforesis en gel de agarosa: los fragmentos pequeños se mueven más rápido a través del gel que los fragmentos más grandes y recorren una distancia más larga. El gel se tiñe con bromuro de etidio y se fotografía con luz ultravioleta. De esta forma, se puede obtener un mapa de restricción de un determinado tipo de microbio.
Al comparar mapas de restricción de ADN aislado de diferentes cepas, es posible determinar su relación genética, identificar la pertenencia a una especie o género específico y también detectar
áreas vivas sujetas a mutaciones. Este método también se utiliza como etapa inicial del método de determinación de la secuencia de pares de nucleótidos (secuenciación) y del método de hibridación molecular.
Determinación del perfil plasmídico de bacterias. El perfil plasmídico permite la identificación intraespecífica de bacterias. Para ello, se aísla el ADN plasmídico de la célula bacteriana, que se separa mediante electroforesis en un gel de agarosa para determinar el número y tamaño de los plásmidos.
Ribotipado. La secuencia de bases de nucleótidos en los operones que codifican el ARNr se caracteriza por la presencia tanto de regiones conservadoras que han sufrido cambios menores durante la evolución y tienen una estructura similar en diferentes bacterias, como de secuencias variables que son específicas de género y especie y son marcadores de genética. identificación. Estos operones están presentes en el cromosoma bacteriano en varias copias. Los fragmentos de ADN obtenidos después de procesarlos con enzimas de restricción contienen secuencias de genes de ARNr que pueden detectarse mediante hibridación molecular con ARNr marcado de la especie bacteriana correspondiente. El número y la ubicación de las copias de los operones de ARNr y la composición de los sitios de restricción tanto dentro del operón de ARNr como a lo largo de sus flancos varían entre las diferentes especies bacterianas. El método se basa en esta propiedad. ribotipado, lo que permite monitorear cepas aisladas y determinar su tipo. Actualmente, la ribotipificación se realiza de forma automática en dispositivos especiales.
5.6.2. Métodos utilizados para detectar un microbio sin aislarlo en un cultivo puro.
El método de hibridación molecular nos permite determinar el grado de similitud entre diferentes ADN. Se utiliza en la identificación de microbios para determinar su posición taxonómica exacta, así como para detectar el microbio en el material en estudio sin aislarlo en un cultivo puro. El método se basa en la capacidad del ADN bicatenario de desnaturalizarse a temperaturas elevadas (90 °C) en un ambiente alcalino, es decir, se desenreda en dos hebras y, cuando la temperatura baja 10 °C, se restaura de nuevo la estructura original de doble cadena. El método requiere una sonda molecular.
Investigacion es una molécula de ácido nucleico monocatenario marcada con nucleidos radiactivos, una enzima o un tinte fluorocromo, con la que se compara el ADN que se analiza.
Para llevar a cabo la hibridación molecular, el ADN en estudio se desenreda de la manera descrita anteriormente, una cadena se fija en un filtro especial, que luego se coloca en una solución que contiene una sonda. Se crean condiciones favorables para la formación de dobles hélices. Si hay complementariedad entre la sonda y el ADN que se está analizando, forman entre sí una doble hélice, cuya presencia se detecta mediante métodos que dependen del tipo de etiqueta de la sonda: recuento de radioactividad, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o densitometría. .
Determinar la presencia de un microbio en el material de prueba mediante un microchip
El microchip es una placa de vidrio con entre 100 y 1000 sondas de ADN molecular asociadas, que representan una secuencia de nucleótidos específica de una unidad taxonómica determinada, localizada en determinadas zonas (Fig. 5.6).
Arroz. 5.6. El principio de detectar una secuencia de ADN específica mediante un microchip.
Se aísla el ADN total de la muestra de prueba, que puede amplificarse a partir de la secuencia estable del gen 16S RNA. El ADN aislado se marca con un fluorocromo o enzima y el microchip se trata con él, creando las condiciones para la hibridación. El ADN no unido se elimina por lavado y la localización de los híbridos moleculares se determina mediante ELISA o densitometría.
La reacción en cadena de la polimerasa permite detectar un microbio en el material en estudio (agua, productos, material de un paciente) por la presencia de ADN microbiano en él sin aislar este último en un cultivo puro.
Para llevar a cabo esta reacción se aísla ADN del material en estudio, en el que se determina la presencia de un gen específico de un determinado microbio. El gen se detecta por su acumulación. Para hacer esto, es necesario tener cebadores (semillas) complementarios a los extremos de 3" del ADN del gen original. La acumulación (amplificación) del gen se realiza de la siguiente manera. El ADN aislado del material de prueba se calienta. En este caso, el ADN se divide en 2 cadenas. Se añaden cebadores. La mezcla de ADN y cebadores se enfría. En este caso, los cebadores, si el gen deseado está presente en la mezcla de ADN, se unen a sus regiones complementarias. Luego A la mezcla de ADN y cebador se le añade ADN polimerasa y nucleótidos. Se fija la temperatura que es óptima para el funcionamiento de la ADN polimerasa. En estas condiciones, si el ADN del gen y el cebador son complementarios, se añaden nucleótidos a los 3" extremos de los cebadores, lo que da como resultado la síntesis de dos copias del gen. Después de esto, el ciclo se repite nuevamente, duplicándose la cantidad de ADN genético cada vez (Fig. 5.7). La reacción se lleva a cabo en dispositivos especiales: amplificadores. El resultado se evalúa mediante densitometría posterior del ADN amplificado o su electroforesis en un gel de poliacrilamida. La PCR se utiliza para diagnosticar infecciones virales y bacterianas.
PCR en tiempo real representa un método de PCR acelerado en el que la amplificación y la determinación del producto de amplificación se llevan a cabo simultáneamente. Para ello, se introduce una sonda molecular en el tubo de amplificación que, unida a la cadena amplificada, genera una señal fluorescente de una determinada longitud de onda. La reacción se lleva a cabo de forma automática.
Arroz. 5.7. Reacción en cadena de la polimerasa (esquema)
Amplificación mediada por transcripción El ARNr se utiliza para diagnosticar infecciones mixtas. Este método se basa en la detección mediante hibridación molecular de ARNr amplificados específicos de una especie bacteriana concreta. El estudio se lleva a cabo en tres etapas:
Amplificación de un conjunto de ARNr en una matriz de ADN aislado del material de prueba utilizando ARN polimerasa dependiente de ADN;
Hibridación del conjunto de ARNr acumulado con oligonucleótidos de ARNr específicos de especies complementarios marcados con fluorocromo o enzimas;
Determinación de productos de hibridación mediante densitometría y ELISA.
La reacción se lleva a cabo de forma automática en instalaciones en las que la determinación simultánea de ARNr de diferentes especies bacterianas se consigue dividiendo el conjunto de ARNr amplificado en varias muestras, a las que se añaden oligonucleótidos marcados complementarios al ARNr específico de la especie para la hibridación.
Considerados como factores mutagénicos de naturaleza biológica son móvil (= migrando ) elementos genéticos de las bacterias – segmentos de ADN discretos capaces de moverse de forma independiente de una región a otra dentro de un replicón, así como de un replicón (cromosómico, plásmido o fago) a otro. Estos elementos incluyen: secuencias de inserción simples (elementos IS), transposones (elementos Tn) y transposones de fagos (Mu, D3112, etc.). Su integración en replicones se produce independientemente del sistema de recombinación celular general, lo que requiere una homología obligatoria en las estructuras recombinantes.
ES elementos Son fragmentos lineales de ADN bicatenario de entre 200 y 2000 pb de longitud. Sólo contienen genes. tnp, que codifica la síntesis de la enzima transposasa necesaria para su migración (transposición). En los extremos de los elementos IS hay repeticiones terminales invertidas (ITR). Para diferentes elementos IS, la longitud de las repeticiones ITR terminales varía de 8 a 40 pb. Las repeticiones invertidas también participan y son importantes para la transposición. La estructura del elemento IS se puede representar esquemáticamente de la siguiente manera:
Hay varios tipos de elementos IS: IS1, IS2, IS3, IS4, etc. Se diferencian entre sí por la longitud y la estructura de las repeticiones terminales.
Los elementos IS son componentes normales de los cromosomas y plásmidos bacterianos. Diferentes replicones pueden contener números diferentes, y a menudo múltiples, de copias de elementos IS. Los elementos IS pueden pasar de una región del genoma a otra, por ejemplo, de un cromosoma bacteriano a un plásmido o de un plásmido a otro. También pueden insertarse dentro de un solo gen e inactivarlo o cambiar su regulación.
Transposones – elementos migratorios complejos. Designado como Tn 1, Tn 2,... Tn100, Tn 1002, etc. Se diferencian de los elementos IS en que, además de los genes responsables de la transposición, contienen genes estructurales que son responsables de la manifestación de cualquier fenotipo. Los transposones pueden controlar la resistencia a los antibióticos y los iones de metales pesados, la capacidad de catabolizar la lactosa, la rafinosa, la degradación del tolueno, la síntesis de enterotoxinas, etc., por lo que son más fáciles de detectar que los elementos IS. La longitud de los transposones supera los 2000 pb. Al igual que los elementos IS, los transposones tienen repeticiones terminales invertidas (ITR), que a menudo son elementos IS. Los transposones se distinguen no sólo por su estructura y composición, sino también por el grado de especificidad en la elección de los sitios de integración en los replicones. Sin embargo, cabe señalar que la especificidad de transposición del mismo transposón para diferentes especies bacterianas y replicones puede ser diferente.
La frecuencia de migración de transposones y elementos IS ocurre con una probabilidad de 10 –4 –10 –7 por división celular bacteriana. Puede depender de la naturaleza de los replicones del donante y del receptor, así como del genoma de la célula huésped. Además, el movimiento de los transposones puede verse influenciado por factores ambientales (temperatura, rayos ultravioleta, compuestos químicos, etc.). Los mecanismos del movimiento de los transposones no se comprenden completamente.
Bacteriófago Mu Pertenece a los bacteriófagos moderados. Su rasgo característico es la mutagenicidad, que se refleja en el nombre. mu (mu tator). Este bacteriófago fue descubierto por primera vez en bacterias. E. coli, pero también se reproduce en las células Shigella, Klebsiella, Pseudomonas, citrobacter, Salmonela etc. Se clasifica como un elemento genético móvil, ya que en muchos aspectos es similar a los elementos IS y los transposones y esencialmente se diferencia solo en que puede formar partículas virales. La similitud con los elementos IS y los transposones se expresa principalmente en el hecho de que el genoma del fago Mu (ADN bicatenario lineal - 38 kb) también tiene repeticiones invertidas en los extremos, pero sólo de dos pares de nucleótidos.